3. Nội dung nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của gen chuyển
2.3.5.1. Phương pháp tách chiết RNA
RNA tổng số được tách chiết từ lá của các dòng thuốc lá thí nghiệm bằng Trizol® LS reagent theo hướng dẫn của hãng (Ambion - Life Technology Corporation, Mỹ). DNA tổng số và RNA tổng số được kiểm tra trên gel agarose 1 .
2.3.5.2. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR
Tổng hợp cDNA bằng RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Mỹ).
C p mồi sử dụng cho phân tích RT-PCR có trình tự nucleotide là: F3’5’H- NcoI-F/:5’-AGCCATGGATGTTGTCTACCAGAGAACTTGTCGCTGCAGCGA TCATTTTTTTCATT-3’F3’5’H-SacI-R: 5’-TAAGCTCGCTGATGTATTCGTCTC CCA C-3’.
Đoạn DNA nhân bản dự kiến có kích thước 1581 bp.
2.4. Phƣơng pháp phân tích số liệu
Sử dụng chương trình Excel và các phần mềm chuyên dụng để phân tích và xử lý số liệu theo Chu Hoàng Mậu và đtg (2019).
27
CHƢƠNG 3. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đ c iểm của c u trúc vector pCB301_AcF3'5'H
Gen F3'5'H phân lập từ cây Ô đầu được thiết kế thành vector
pCB301_AcF3’5’H trong vi khuẩn A.tumefaciens là sản phẩm của đề tài cấp Bộ
Giáo dục và Đào tạo, mã số B2020-TNA-11 do TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan làm chủ nhiệm được sử dụng làm vật liệu biến nạp vào cây thuốc lá. Sơ đồ cấu trúc vector
chuyển gen pCB301_AcF3’5’H được mô tả trên hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H.
Theo hình 3.1 các phân đoạn được thiết kế trong vector gồm 2 phần chính.
Phần thứ nhất mang gen nptII, có kí hiệu gồm Nos-nptII-Ter. Theo đó, Nos là
promoter phân lập từ gen mã hóa enzyme nopaline synthase của A.tumefaciens. Nos
được sử dụng làm promoter của gen nptII. Phần có kí hiệu là nptII là đoạn mã hóa
amino glycosid 3’phosphotransferase II, sản phẩm này có tính đối kháng với kháng
sinh. Các loại kháng sinh đều bị sản phẩm của gen nptII làm cho bất hoạt với mức độ
không giống nhau; Phần có kí hiệu Ter là đoạn cuối trong phần thứ nhất, có vai trò
kết thúc chức năng của gen nptII.
Phần thứ hai mang gen AcF3’5’H được thiết kế gồm phần CaMV35S, đây là
promoter phân lập từ virus gây bệnh khảm trên cây súp lơ. Promoter CaMV35S có thể khởi động phiên mã gen chuyển ở tất cả các tế bào và mô trên cơ thể thực vật.
Tiếp theo là đoạn AcF3’5’H, đây là đoạn mã hóa gen F3’5’H của cây Ô đầu (A.
carmichaelii). Đoạn AcF3’5’H chiều dài 1,521 bp, mã hóa cho 506 amino acid. Phần tiếp theo gồm các đoạn cmyc, KDEL, đây là những trình tự nucleotit mã hóa peptit c- myc; KDEL. Các peptit này thường dùng để xác định sự có m t của sản phẩm protein đích khi dùng phản ứng Western blot ho c ELISA.
28
Phần cuối cùng trong cấu trúc là các kí hiệu Hind III, NcoI, NotI, đây là các
enzyme cắt hạn chế.
Như vậy, bất kỳ một tế bào chủ nào (có thể là vi khuẩn, mô tế bào thực vật)
khi nhận được vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H sẽ sống sót trên môi trường
chọn lọc có kháng sinh thuộc nhóm amino glycosid. Ngược lại các tế bào không
mang gen nptII sẽ bị chết khi nuôi trong môi trường kháng sinh, đó là căn cứ để
chúng tôi lựa chọn kháng sinh bổ sung vào các môi trường chọn lọc từ đồng nuôi cấy tế bào, tái sinh chồi, tạo rễ.
Với các tế bào mô thực vật cần biểu hiện gen AcF3’5’H từ cấu trúc pCB301_
AcF3’5’H thì sự biểu hiện sẽ xảy ra ở tất cả các tế bào và mô nhờ sự có m t của promoter CaMV35S. Đồng thời có thể kiểm tra sự có m t của các đoạn gen mong muốn khi bổ sung vào c p mồi các trình tự của enzyme cắt hạn chế. Trong nghiên
cứu tiếp theo chúng tôi lựa chọn bổ sung vị trí cắt của hai enzyme NotI và NcoI vào
gen AcF3’5’H do đó đoạn DNA nhân bản dự kiến có kích thước 1536 bp
3.2. Kết quả tạo cây thuốc lá biến nạp gen
3.2.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá thông qua A. tumefaciens thông qua A. tumefaciens
Biến nạp "transformation" là hiện tượng chuyển một đoạn DNA của tế bào này (gọi là tế bào cho) sang tế bào khác (gọi là tế bào nhận). Kết thúc hiện tượng biến nạp tế bào nhận sẽ có DNA mới gọi là DNA ngoại lai (exogenous DNA). Trong thí
nghiệm của chúng tôi, biến nạp chính là sự chuyển cấu trúc pCB301_ AcF3’5’H từ vi
khuẩn A. tumefaciens sang tế bào nhận là mô lá của thuốc lá. Các bước cơ bản của
quá trình biến nạp vi khuẩn bao gồm: nuôi dịch vi khuẩn đạt nồng độ mong muốn, ngâm mảnh tế bào nhận gen và cùng nuôi cấy hai loại tế bào cho và nhận trong một khoảng thời gian nhất định.
Theo đó, vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc gen chuyển AcF3’5’H (Hình
3.1) được nuôi tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp vào mô lá thuốc lá. Thí nghiệm đã tiến hành bằng cách sử dụng 10 ml dịch khuẩn bổ sung vào 40 ml LB
lỏng, nuôi trên máy lắc ở 28oC, với tốc độ 200 vòng/phút. Sau khoảng 2 đến 4 giờ,
29
A B C D
đạt trong khoảng 0,6 đến 0,8 là số lượng tế bào tối ưu để thực hiện biến nạp. Toàn bộ
dịch nuôi được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/1phút, trong 15 phút, ở nhiệt độ 4oC. Sau
15 phút, bỏ dịch nổi, thu c n. Hòa tan c n thu được bằng dung dịch ½ MS là dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp.
Đồng thời với việc nuôi khuẩn, lá non của cây thuốc lá in vitro được gây tổn
thương bằng cách cắt thành các mảnh có kích thước khoảng 1x1 cm làm vật liệu để
tiến hành lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pCB301_AcF3’5’H. Khi
chưa nhiễm khuẩn cần ngâm mảnh lá trong dung dịch ½ MS để tránh mảnh lá bị khô và bị tổn thương mép lá.
Hình 3.2 mô tả nguyên liệu và tóm tắt quá trình biến nạp cấu trúc mang gen
chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá thông qua A. tumefaciens. Theo đó, hình 3.2A là
các cây thuốc lá in vitro là nguyên liệu chuyển gen. Hình 3.2B là dịch nuôi phục hồi
vi khuẩn A. tumefaciens sau 4 giờ. Hình 3.2 C các mảnh lá thuốc lá ngâm trong dịch
huyền phù khuẩn A. tumefaciens trong 15 phút. Sau 15 phút gắp các mảnh lá lên giấy
thấm vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường đồng nuôi cấy, nuôi trong 2 ngày và trong điều kiện không có ánh sáng.
Hình 3.2. Hình ảnh mô tả quá trình chuẩn bị và biến nạp gen vào cây thuốc lá
A: Cây thuốc lá in vitro là nguyên liệu chuyển gen;
B: Dịch vi khuẩn nuôi phục hồi sau 4 giờ;
C: Mảnh lá thuốc lá ngâm trong dịch khuẩn;
D: Mảnh lá thuốc lá trên môi trường đồng nuôi cấy.
Như vậy, thí nghiệm biến nạp gen vào mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận
được cấu trúc pC301_AcF3’5’H trong vi khuẩn A. tumefaciens ở điều kiện có nồng
30
3.2.2. Kết quả tái sinh cây từ mảnh lá của cây thuốc lá
Tái sinh (regeneration) là hiện tượng mô và tế bào nuôi cấy bị kích thích phát triển thành phôi, mầm chồi, rễ ho c cây hoàn chỉnh. Việc biểu hiện tính toàn năng (totipotency) hay tái sinh cây nguyên vẹn từ những tế bào soma là một trong những
vấn đề chính của kỹ thuật nuôi cấy in vitro [4]. Trong thí nghiệm này, mảnh lá của
thuốc lá được tái sinh cây gồm hai giai đoạn tạo đa chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Các kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin và kháng sinh được nghiên cứu và bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Kháng sinh nhóm aminoglycosid là nhóm kháng sinh diệt khuẩn được lấy từ nấm. Trong cấu trúc hóa học của nhóm này có đường cùng với chức amin. Một số thuốc kháng sinh tiêu biểu trong nhóm có thể kể đến như kháng sinh streptomycin, neomycin, neomycin, kanamycin, amikacin, gentamicin. Phổ kháng khuẩn của sinh nhóm aminoglycosid rộng dùng chủ yếu để chống vi khuẩn hiếu khí gram âm.
Cefotaxime là kháng sinh thuộc nhóm betalactam, có cấu giống penicillin nhưng hoạt tính kháng khuẩn của cefotaxime mạnh hơn penicillin rất nhiều lần, đ c biệt việc kháng với vi khuẩn Gram âm [39].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thường xuyên bổ sung kháng sinh kanamycin và cefotaxime vào môi trường nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu, theo dõi làm căn cứ để xác định hiệu quả chọn lọc cây chuyển gen.
Mảnh lá thuốc lá sau 2 ngày đồng nuôi cấy được mang ra loại bỏ bớt vi khuẩn dư thừa trong dung dịch 1/2MS có bổ sung cefotaxime nồng độ 400mg/l, bằng cách
lắc nhẹ trong 15 phút. Sau 10 phút, thấm khô 2 m t các mảnh lá, chuyển sang môi
trường tái sinh chồi (GM) có bổ sung kháng sinh chọn lọc gồm kanamycin nồng độ
50mg/l và cefotaxime nồng độ 400mg/l để tái sinh. Nuôi trong điều kiện có ánh sáng
khoảng 2000lux, nhiệt độ khoảng 25oC. Để kích thích sự tạo đa chồi, chúng tôi có bổ
sung vào môi trường nuôi cấy kích thích sinh trưởng là BAP (6- Benzyl aminopurin). BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phân hóa chồi, cành [38].
Sau 2-3 tuần từ các mảnh lá xuất hiện các chồi nhỏ. Cụm chồi hình thành sau 4-5 tuần, cắt chuyển sang môi trường kéo dài chồi bổ sung kháng sinh chọn lọc 400 mg/l cefotaxime. Khi các chồi phát triển cao 2 -3 cm thì chuyển sang ra rễ. Bên cạnh
31
việc bổ sung kháng sinh cefotaxime để chọn lọc thì sự tạo rễ được thực hiên trên môi trường có bổ sung IBA là các auxin nhân tạo, có tác dụng kích thích sự ra rễ, đ c biệt là rễ bất định ở cành giâm, cành chiết, mô nuôi cấy [4].
Hình 3.3. Hình ảnh mô tả quá trình tái sinh cây
A: Các cụm chồi được tạo thành sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi được kéo dài trên môi trường chọn lọc;
C: Hình thái cây chuyển gen hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc; D: Rễ của cây hoàn chính trước khi chuyển ra ngoài vườn ươm.
Như vậy, mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H
trong vi khuẩn A. tumefaciens tái sinh được trên môi trường MS có bổ sung BAP 1,5
mg/l, kanamicin 50 mg/l và cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77% với 90 chồi/mẫu. Ra rễ được trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88%. Rễ dài, mập, khỏe.
3.2.3. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm
Các loài cây trồng khi chồi đã ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh với kích thước
nhất định mới được huấn luyện và chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây nuôi cấy in vitro
được sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng...Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần huấn luyện cây để thích nghi với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc đ c biệt [38]. Trong nghiên cứu này, các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trường có kháng sinh chọn lọc và phát triển được 3 đến 4 lá thật thì ra cây ngoài vườn ươm. Đ t bình cây đã đủ điều kiện ra ngoài tự nhiên khỏi phòng nuôi 3 ngày để cây thích nghi với môi trường, sau 3 ngày tiến hành lấy cây ra khỏi bình rửa sạch môi trường thạch còn bám trên rễ. Trồng cây trên khay
32
A B C D
có giá thể xơ dừa khi cây sống sót sau 2 tuần. Tiến hành cấy cây ra bầu, bầu đất gồm đất thịt và trấu hun theo tỉ lệ khoảng 1:1. Cây con 4 đến 5 lá thật thì trồng ra nhà lưới.
Giai đoạn cây được chuyển sang điều kiện tự dưỡng trong điều kiện ngoại cảnh mới. Sau 2 tuần chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đ t trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất là 66,66% (tương đương với Đ/C) (hình 3.4) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh.
Cây trồng trên khay có giá thể xơ dừa sau 2 tuần (Hình 3.4A). Được chuyển trực tiếp ra bầu đất (Hình 3.4B). Cây thuốc lá ngoài vươn ươm (Hình 3.4C). Cây thuốc lá chuyển gen được chăm sóc, theo dõi sinh trưởngng, phát triển đến giai đoạn ra hoa (Hình 3.4D). Cây thuốc lá chuyển gen kết quả và tạo hạt.
Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn thành.
Hình 3.4. Hình ảnh cây thuốc lá chuyển gen in vitro ngoài vườn ươm A: Cây trồng trên khay có giá thể xơ dừa sau 2 tuần
B: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trên bầu đất; C: Cây thuốc lá ngoài vườn ươm;
D: Cây thuốc lá ra hoa kết quả.
Thống kê kết quả biến nạp cấu trúc CaMV35S_AcF3’5’H_cmyc_KDEL trong
vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H được trình bày ở bảng 3.1. Trên bảng 3.1 thể
hiện, với 90 mảnh lá cây thuốc lá là K326 được biến nạp có 68 mảnh sống sót và có số mảnh lá cảm ứng tạo cụm chồi là 61 cụm. Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh là 53 cây.
33
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp c u trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_ DE trong vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H.
Thí nghiệm và ối chứng Tổng số mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 4 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc Số cây ra bầu Số cây sống sót trong nhà lƣới ĐC 0 30 0 0 0 0 0 ĐC 1 30 30 28 14 10 10 Thí nghiệm Lần 1 30 21 19 17 10 7 Lần 2 30 20 17 15 10 5 Lần 3 30 27 25 21 10 8 Tổng thí nghiệm 90 68 61 53 30 20
Kết quả trình bày trên bảng 3.1 cho thấy: ĐC0 là kí hiệu của lô đối chứng (nuôi mảnh mô lá cây thuốc lá không chuyển gen), cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. Trong lô này, không có mảnh lá nào sống sót sau 4 tuần, không có mảnh lá nào cảm ứng tạo chồi. Vì vậy, cũng không có cây ra rễ và cây ra bầu trồng trong nhà lưới.
ĐC1 là kí hiệu của lô đối chứng, trong đó mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh. Trong lô này, có 30 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 28 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 14 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và sống sót trong nhà lưới.
Với lô thí nghiệm, chúng tôi làm l p lại ba lần. Lần thứ nhất có 21 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 19 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 17 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 7 cây sống sót trong nhà lưới. Lần thứ 2 có 20 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 17 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 15 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 5 cây sống sót trong nhà lưới. Lần thứ 3 có 27 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 25 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 21 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 8 cây sống sót trong nhà lưới.
34
Chuyển 30 cây ra bầu đất và có 20 cây sống trong bầu và cây trồng tại nhà lưới có biểu biện xanh tốt, mập mập. Trong khi đó, ở ĐC0 trong 30 mảnh lá không có mẫu nào sống sót; còn ĐC1 lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu được 27 số mẫu cảm ứng tạo chồi, chuyển 14 chồi sang môi trường ra rễ và số cây ra bầu đất là 10 cây và có 10 cây đều sống, sinh trưởng bình thường trong nhà lưới. Như vậy số cây thuốc lá được chuyển gen sống sót trong nhà lưới là 20 cùng với 10 đối chứng không chuyển gen tiếp tục chăm sóc phục vụ những phân tích tiếp theo.
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 3-4 tuần thì tiến hành thu lá thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có m t của gen chuyển.
Như vậy, mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H
trong vi khuẩn A. tumefaciens được tái sinh và tạo thành cây thuốc lá đưa ra ngoài
vườn ươm trồng trên giá thể sau 4 tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66%