3. Nội dung nghiên cứu
3.2.3. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm
Các loài cây trồng khi chồi đã ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh với kích thước
nhất định mới được huấn luyện và chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây nuôi cấy in vitro
được sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, dinh dưỡng...Vì vậy, trước khi đưa ra trồng, người ta cần huấn luyện cây để thích nghi với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc đ c biệt [38]. Trong nghiên cứu này, các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trường có kháng sinh chọn lọc và phát triển được 3 đến 4 lá thật thì ra cây ngoài vườn ươm. Đ t bình cây đã đủ điều kiện ra ngoài tự nhiên khỏi phòng nuôi 3 ngày để cây thích nghi với môi trường, sau 3 ngày tiến hành lấy cây ra khỏi bình rửa sạch môi trường thạch còn bám trên rễ. Trồng cây trên khay
32
A B C D
có giá thể xơ dừa khi cây sống sót sau 2 tuần. Tiến hành cấy cây ra bầu, bầu đất gồm đất thịt và trấu hun theo tỉ lệ khoảng 1:1. Cây con 4 đến 5 lá thật thì trồng ra nhà lưới.
Giai đoạn cây được chuyển sang điều kiện tự dưỡng trong điều kiện ngoại cảnh mới. Sau 2 tuần chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào chậu đất đ t trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất là 66,66% (tương đương với Đ/C) (hình 3.4) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh.
Cây trồng trên khay có giá thể xơ dừa sau 2 tuần (Hình 3.4A). Được chuyển trực tiếp ra bầu đất (Hình 3.4B). Cây thuốc lá ngoài vươn ươm (Hình 3.4C). Cây thuốc lá chuyển gen được chăm sóc, theo dõi sinh trưởngng, phát triển đến giai đoạn ra hoa (Hình 3.4D). Cây thuốc lá chuyển gen kết quả và tạo hạt.
Như vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn thành.
Hình 3.4. Hình ảnh cây thuốc lá chuyển gen in vitro ngoài vườn ươm A: Cây trồng trên khay có giá thể xơ dừa sau 2 tuần
B: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trên bầu đất; C: Cây thuốc lá ngoài vườn ươm;
D: Cây thuốc lá ra hoa kết quả.
Thống kê kết quả biến nạp cấu trúc CaMV35S_AcF3’5’H_cmyc_KDEL trong
vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H được trình bày ở bảng 3.1. Trên bảng 3.1 thể
hiện, với 90 mảnh lá cây thuốc lá là K326 được biến nạp có 68 mảnh sống sót và có số mảnh lá cảm ứng tạo cụm chồi là 61 cụm. Số cây ra rễ trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh là 53 cây.
33
Bảng 3.1. Kết quả biến nạp c u trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_ DE trong vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H.
Thí nghiệm và ối chứng Tổng số mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 4 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc Số cây ra bầu Số cây sống sót trong nhà lƣới ĐC 0 30 0 0 0 0 0 ĐC 1 30 30 28 14 10 10 Thí nghiệm Lần 1 30 21 19 17 10 7 Lần 2 30 20 17 15 10 5 Lần 3 30 27 25 21 10 8 Tổng thí nghiệm 90 68 61 53 30 20
Kết quả trình bày trên bảng 3.1 cho thấy: ĐC0 là kí hiệu của lô đối chứng (nuôi mảnh mô lá cây thuốc lá không chuyển gen), cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. Trong lô này, không có mảnh lá nào sống sót sau 4 tuần, không có mảnh lá nào cảm ứng tạo chồi. Vì vậy, cũng không có cây ra rễ và cây ra bầu trồng trong nhà lưới.
ĐC1 là kí hiệu của lô đối chứng, trong đó mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh. Trong lô này, có 30 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 28 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 14 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và sống sót trong nhà lưới.
Với lô thí nghiệm, chúng tôi làm l p lại ba lần. Lần thứ nhất có 21 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 19 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 17 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 7 cây sống sót trong nhà lưới. Lần thứ 2 có 20 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 17 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 15 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 5 cây sống sót trong nhà lưới. Lần thứ 3 có 27 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, có 25 mảnh lá cảm ứng tạo chồi, có 21 cây ra rễ trên môi trường chọn lọc, có 10 cây ra bầu và có 8 cây sống sót trong nhà lưới.
34
Chuyển 30 cây ra bầu đất và có 20 cây sống trong bầu và cây trồng tại nhà lưới có biểu biện xanh tốt, mập mập. Trong khi đó, ở ĐC0 trong 30 mảnh lá không có mẫu nào sống sót; còn ĐC1 lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu được 27 số mẫu cảm ứng tạo chồi, chuyển 14 chồi sang môi trường ra rễ và số cây ra bầu đất là 10 cây và có 10 cây đều sống, sinh trưởng bình thường trong nhà lưới. Như vậy số cây thuốc lá được chuyển gen sống sót trong nhà lưới là 20 cùng với 10 đối chứng không chuyển gen tiếp tục chăm sóc phục vụ những phân tích tiếp theo.
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 3-4 tuần thì tiến hành thu lá thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có m t của gen chuyển.
Như vậy, mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H
trong vi khuẩn A. tumefaciens được tái sinh và tạo thành cây thuốc lá đưa ra ngoài
vườn ươm trồng trên giá thể sau 4 tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66%
3.3. ết quả phân tích sự có m t của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Cho đến nay có nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA của thực vật. Tuy nhiên đều theo nguyên tắc chung là (1) phá vỡ mô, màng tế bào bằng các biện pháp cơ học, (2) sử dụng CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) làm cho DNA dễ hòa tan, tách polysacharide và ARN ra khỏi DNA. (3) Sử dụng hóa chất (chủ yếu là EDTA) để bảo vệ tế bào tránh khỏi sự phân hủy của các enzyme nội bào, (4) Tiếp tục sử dụng các hóa chất như chloroform, isoamyl alcohol… để loại protein và các tạp chất. (5) Thu hồi DNA bằng cách kết tủa trong cồn ho c isopropanol…Sau đó ly tâm, thu tủa DNA và hòa tan DNA trong nước cất ho c dung dịch đệm được dung dịch DNA để bảo quản.
DNA sau khi tách chiết có thể kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo quang phổ ho c điện di. Để đánh giá độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ người ta đo dung dịch DNA thu được ở bước sóng 260 nm (phổ hấp phụ cực đại
35
trong khoảng 1,8 đến 2,0 thì có thể xem dịch chiết DNA đã tinh sạch. Để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn của phân tử DNA bằng phương pháp điện di thì cần thiết phải có gel agarose. Các bản gel đóng vai trò như các tấm lưới để các phân tử DNA vượt qua. Sau khi điện di, các phân tử DNA sẽ được hiện hình bằng cách nhuộm với thuốc thử ethidium bromid. Thuốc thử này tạo liên kết với các base nito, do vậy khi chiếu tia UV ở bước sóng khoảng 300 nm, phần có DNA sẽ phát quang màu da cam. Nếu phổ điện di của dung dịch DNA cho hình một dải băng rộng, ho c gồm nhiều vạch thì chứng tỏ DNA bị đứt gãy nhiều ho c còn lẫn tạp chất. Phố điện di là một băng gọn, rõ chứng tỏ DNA là không bị đứt gãy và đảm bảo độ tinh sạch.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của các
mẫu cây thuốc lá theo phương pháp của Saghai-Maroof và đtg (1984) như mô tả
trọng mục 2.3.4.1[28].
Chúng tôi chọn 14 cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0 sau 3-4 tuần ra cây có biểu hiện sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện nhà lưới. Các dòng cây được chọn ký hiệu là T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12, T0-13, T0-14 và cây thuốc lá không chuyển gen (cây WT) để
tách chiết DNA tổng số và kiểm tra sự có m t của gen chuyển AcF3’5’H trong cây
chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. DNA tổng số từ các mẫu lá được tách chiết và điện di kiểm tra trên gel 0,8% (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả điện di DNA tổng số
(1-14: DNA tổng số của các dòng cây thuốc lá chuyển gen ĐC: là mẫu cây WT)
Kết quả trên hình 3.5 là DNA của 14 mẫu cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và mẫu cây đối chứng (WT). Sau khi điện di DNA tổng số, kết quả cho thấy chỉ có
36
một bằng chính tương đối sáng và rõ nét tập trung các phân tử DNA. Điều này chứng tỏ, DNA tách chiết từ các mẫu cây thuốc lá nghiên cứu tương đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sủ dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.
3.3.2. Kết quả nhân gen AcF3’5’H bằng kỹ thuật PCR
Tiến hành phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu F3’5’H-NcoI-F và F3’5’H-
NotI-R (bảng 2.4) nhân bản đoạn gen AcF3’5’H từ DNA hệ gen của 14 dòng cây thuốc lá T0, kết quả thể hiện ở hình 3.6.
Hình ảnh điện di ở hình 3.6. cho thấy, có 6 dòng cây gọi là dương tính với PCR, biểu hiện ở làn chạy số 2, 4, 6, 10, 12, 14. vì trên gel điện di xuất hiện một đoạn DNA duy nhất, có kích thước 1,5 kb, tương ứng với kích thước dự kiến của gen
chuyển AcF3’5’H (1536 bp). Ngược lại, các làn chạy số 1, 3, 5, 7, 8, 9,11, 13 không
xuất hiện băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ không có gen AcF3’5’H
được chuyển vào.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen AcF3’5’H từ các cây thuốc lá chuyển gen T0.
1-14: Các dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0; M: Thang chuẩn DNA 1kb; WT: Cây thuốc lá không chuyển gen; (+): Sản phẩm PCR từ cấu trúc chuyển gen
pCB301_AcF3’5’H
Như vậy, kết quả phân tích ban đầu có thể dự đoán rằng cấu trúc mang gen
chuyển pC301_AcF3’5’H có thể đã được dung hợp vào hệ gen cây thuốc lá.
Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn phân tích kết quả PCR xác nhận được 6/90 cây T0 dương tính với PCR, đạt hiệu suất chuyển gen 6,67%. Các cây chuyển gen
37
dương tính với PCR ở giai đoạn T0 ký hiệu là T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T0- 14 tiếp tục được theo dõi ngoài vườn ươm để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích sinh vật chuyển gen là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện ở các phòng thí nghiệm. Gen chuyển là các gen đã biết, kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy chỉ cần: Tách chiết DNA genome của sinh vật chuyển gen; sử dụng c p mồi đ c hiệu của gen để khuếch đại bằng phản ứng PCR; Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose. Nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như dự kiến thì mẫu phân tích được coi là dương tính, đồng nghĩa với chuyển gen thành công. Tuy nhiên, kết quả PCR dương tính cũng có thể (1) vi khuẩn mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong gian bào của mẫu phân tích; (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính; (3) gen chuyển không hoạt động, tức là không được biểu hiện thành protein có chức năng sinh học... Do đó, phân tích sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật PCR chỉ mới có giá trị định hướng ban đầu cần thiết phải được nghiên cứu nhiều hơn để kết quả tạo sinh vật chuyển gen được công nhận.
3.4. ết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0
Sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 được
đánh giá bước đầu bằng kỹ thuật RT-PCR. Sự biểu hiện gen đang ở mức phiên mã (tạo ra RNA). Kết quả phân tích trình bày trên hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả RT-PCR khuếch đại gen AcF3’5’H
(cDNA) từ các cây thuốc lá biến nạp.
M: thang DNA 1kb; WT: Cây thuốc lá không biến nạp; (+): Vector pCB301_AcF3’5’H; 1-6 các cây thuốc lá được biến nạp gen AcF3’5’H ở thế hệ T0 tương ứng T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T0-14
Hình ảnh điện di ở hình 3.7. cho thấy, có 3 dòng cây gọi là dương tính với RT- PCR, biểu hiện ở làn chạy số 2, 3, 6, tương ứng với kích thước dự kiến của gen
38
chuyển AcF3’5’H (1,581 bp). Ngược lại, các làn chạy số 1, 3, 5, 7 không xuất hiện
băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ gen AcF3’5’H không được biểu hiện
ở thế hệ T0.
Hiệu suất biến nạp gen ở giai đoạn phân tích kết quả RT-PCR xác nhận được 3/90 cây T0, đạt hiệu suất chuyển gen 3,33%. Các cây chuyển gen dương tính với RT-PCR ở giai đoạn T0 ký hiệu là T0-4, T0-6, T0-14 tiếp tục được theo dõi ngoài vườn ươm để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
39
ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ Kết luận:
1. Cấu trúc của vector trúc pC301_AcF3’5’H gồm có hai phần: (1) Phần mang gen nptII mã hóa amino glycosid 3’phosphotransferase có tính đối kháng với kháng sinh
thuộc nhóm amino glycosid và (2) Phần mang gen AcF3’5’H mã hóa flavonoid 3' 5'
hydroxylase phân lập từ cây Ô đầu.
2. Biến nạp cấu trúc pC301_AcF3’5’H nhờ vi khuẩn A. tumefaciens vào mô lá cây
thuốc lá K326 trong điều kiện có nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 0,6 – 0,8. Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamicin 50 mg /l và cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77%. Ra rễ cây trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88%, chất lượng rễ tốt. Cây con đưa ra ngoài vườn ươm trồng trên giá thể sau 4 tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66%.
3. Xác định sự có m t của gen chuyển AcF3’5’H vào mô lá thuốc lá K326 nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens đã được xác định được 6/90 cây T0 dương tính với PCR, đạt
hiệu suất chuyển gen 6,67%.
4. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển AcF3’5’H bằng kỹ thuật RT-PCR đã xác
định được 3/90 cây T0 dương tính với RT- PCR, hiệu suất biến nạp gen 3,33%.
Kiến nghị:
Tiếp tục đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ protein bằng các kỹ thuật như Western ho c ELISA.
40
TÀI LIỆU THAM HẢO Tiếng Việt:
1. Bộ môn cây công nghiệp Trường Đại học nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,
Giáo trình giảng dạy cây thuốc lá, Nxb Thành Phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Thị Ngọc Lan, Từ Quang Tân, Chu Hoàng Mậu (2020), Sinh học hiện
đại-một số vấn đề về nguyên lý và ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội.
3. Phutthakone Vaciaxa, Trần Thị Hồng, Phạm Thị Thanh Nhàn, Vũ Thị Thu
Thủy, Chu Hoàng Mậu (2021), “Nghiên cứu biến nạp gen GmDREB6 thông
qua Agrobacterium tumefaciens ở giống đậu tương”, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ Đại học Thái Nguyên. 226(01), pp. 57-64.
4. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật và ứng
dụng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
5. Vì Th Đại học Thái Nguyên.và ứng dụng), ái Nguyênterium tumefaciens ở
giống đậu tương.ốt. phục vụ cho các nghiên cứu tiếpnhờ Agrobacterium
tumefaciens”, T,ien của nsm Thái Nguyên.và ứng dụng), ái Nguyên. 19(8).