3. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá
thông qua A. tumefaciens
Biến nạp "transformation" là hiện tượng chuyển một đoạn DNA của tế bào này (gọi là tế bào cho) sang tế bào khác (gọi là tế bào nhận). Kết thúc hiện tượng biến nạp tế bào nhận sẽ có DNA mới gọi là DNA ngoại lai (exogenous DNA). Trong thí
nghiệm của chúng tôi, biến nạp chính là sự chuyển cấu trúc pCB301_ AcF3’5’H từ vi
khuẩn A. tumefaciens sang tế bào nhận là mô lá của thuốc lá. Các bước cơ bản của
quá trình biến nạp vi khuẩn bao gồm: nuôi dịch vi khuẩn đạt nồng độ mong muốn, ngâm mảnh tế bào nhận gen và cùng nuôi cấy hai loại tế bào cho và nhận trong một khoảng thời gian nhất định.
Theo đó, vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc gen chuyển AcF3’5’H (Hình
3.1) được nuôi tạo dịch huyền phù vi khuẩn để biến nạp vào mô lá thuốc lá. Thí nghiệm đã tiến hành bằng cách sử dụng 10 ml dịch khuẩn bổ sung vào 40 ml LB
lỏng, nuôi trên máy lắc ở 28oC, với tốc độ 200 vòng/phút. Sau khoảng 2 đến 4 giờ,
29
A B C D
đạt trong khoảng 0,6 đến 0,8 là số lượng tế bào tối ưu để thực hiện biến nạp. Toàn bộ
dịch nuôi được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/1phút, trong 15 phút, ở nhiệt độ 4oC. Sau
15 phút, bỏ dịch nổi, thu c n. Hòa tan c n thu được bằng dung dịch ½ MS là dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp.
Đồng thời với việc nuôi khuẩn, lá non của cây thuốc lá in vitro được gây tổn
thương bằng cách cắt thành các mảnh có kích thước khoảng 1x1 cm làm vật liệu để
tiến hành lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp chứa cấu trúc pCB301_AcF3’5’H. Khi
chưa nhiễm khuẩn cần ngâm mảnh lá trong dung dịch ½ MS để tránh mảnh lá bị khô và bị tổn thương mép lá.
Hình 3.2 mô tả nguyên liệu và tóm tắt quá trình biến nạp cấu trúc mang gen
chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá thông qua A. tumefaciens. Theo đó, hình 3.2A là
các cây thuốc lá in vitro là nguyên liệu chuyển gen. Hình 3.2B là dịch nuôi phục hồi
vi khuẩn A. tumefaciens sau 4 giờ. Hình 3.2 C các mảnh lá thuốc lá ngâm trong dịch
huyền phù khuẩn A. tumefaciens trong 15 phút. Sau 15 phút gắp các mảnh lá lên giấy
thấm vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường đồng nuôi cấy, nuôi trong 2 ngày và trong điều kiện không có ánh sáng.
Hình 3.2. Hình ảnh mô tả quá trình chuẩn bị và biến nạp gen vào cây thuốc lá
A: Cây thuốc lá in vitro là nguyên liệu chuyển gen;
B: Dịch vi khuẩn nuôi phục hồi sau 4 giờ;
C: Mảnh lá thuốc lá ngâm trong dịch khuẩn;
D: Mảnh lá thuốc lá trên môi trường đồng nuôi cấy.
Như vậy, thí nghiệm biến nạp gen vào mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận
được cấu trúc pC301_AcF3’5’H trong vi khuẩn A. tumefaciens ở điều kiện có nồng
30