3. Nội dung nghiên cứu
3.2.2. Kết quả tái sinh cây từ mảnh lá của cây thuốc lá
Tái sinh (regeneration) là hiện tượng mô và tế bào nuôi cấy bị kích thích phát triển thành phôi, mầm chồi, rễ ho c cây hoàn chỉnh. Việc biểu hiện tính toàn năng (totipotency) hay tái sinh cây nguyên vẹn từ những tế bào soma là một trong những
vấn đề chính của kỹ thuật nuôi cấy in vitro [4]. Trong thí nghiệm này, mảnh lá của
thuốc lá được tái sinh cây gồm hai giai đoạn tạo đa chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Các kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin và kháng sinh được nghiên cứu và bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Kháng sinh nhóm aminoglycosid là nhóm kháng sinh diệt khuẩn được lấy từ nấm. Trong cấu trúc hóa học của nhóm này có đường cùng với chức amin. Một số thuốc kháng sinh tiêu biểu trong nhóm có thể kể đến như kháng sinh streptomycin, neomycin, neomycin, kanamycin, amikacin, gentamicin. Phổ kháng khuẩn của sinh nhóm aminoglycosid rộng dùng chủ yếu để chống vi khuẩn hiếu khí gram âm.
Cefotaxime là kháng sinh thuộc nhóm betalactam, có cấu giống penicillin nhưng hoạt tính kháng khuẩn của cefotaxime mạnh hơn penicillin rất nhiều lần, đ c biệt việc kháng với vi khuẩn Gram âm [39].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thường xuyên bổ sung kháng sinh kanamycin và cefotaxime vào môi trường nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu, theo dõi làm căn cứ để xác định hiệu quả chọn lọc cây chuyển gen.
Mảnh lá thuốc lá sau 2 ngày đồng nuôi cấy được mang ra loại bỏ bớt vi khuẩn dư thừa trong dung dịch 1/2MS có bổ sung cefotaxime nồng độ 400mg/l, bằng cách
lắc nhẹ trong 15 phút. Sau 10 phút, thấm khô 2 m t các mảnh lá, chuyển sang môi
trường tái sinh chồi (GM) có bổ sung kháng sinh chọn lọc gồm kanamycin nồng độ
50mg/l và cefotaxime nồng độ 400mg/l để tái sinh. Nuôi trong điều kiện có ánh sáng
khoảng 2000lux, nhiệt độ khoảng 25oC. Để kích thích sự tạo đa chồi, chúng tôi có bổ
sung vào môi trường nuôi cấy kích thích sinh trưởng là BAP (6- Benzyl aminopurin). BAP thuộc nhóm cytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phân hóa chồi, cành [38].
Sau 2-3 tuần từ các mảnh lá xuất hiện các chồi nhỏ. Cụm chồi hình thành sau 4-5 tuần, cắt chuyển sang môi trường kéo dài chồi bổ sung kháng sinh chọn lọc 400 mg/l cefotaxime. Khi các chồi phát triển cao 2 -3 cm thì chuyển sang ra rễ. Bên cạnh
31
việc bổ sung kháng sinh cefotaxime để chọn lọc thì sự tạo rễ được thực hiên trên môi trường có bổ sung IBA là các auxin nhân tạo, có tác dụng kích thích sự ra rễ, đ c biệt là rễ bất định ở cành giâm, cành chiết, mô nuôi cấy [4].
Hình 3.3. Hình ảnh mô tả quá trình tái sinh cây
A: Các cụm chồi được tạo thành sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi được kéo dài trên môi trường chọn lọc;
C: Hình thái cây chuyển gen hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc; D: Rễ của cây hoàn chính trước khi chuyển ra ngoài vườn ươm.
Như vậy, mảnh lá của giống thuốc lá K326 nhận cấu trúc pC301_AcF3’5’H
trong vi khuẩn A. tumefaciens tái sinh được trên môi trường MS có bổ sung BAP 1,5
mg/l, kanamicin 50 mg/l và cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77% với 90 chồi/mẫu. Ra rễ được trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88%. Rễ dài, mập, khỏe.