3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Cho đến nay có nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA của thực vật. Tuy nhiên đều theo nguyên tắc chung là (1) phá vỡ mô, màng tế bào bằng các biện pháp cơ học, (2) sử dụng CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) làm cho DNA dễ hòa tan, tách polysacharide và ARN ra khỏi DNA. (3) Sử dụng hóa chất (chủ yếu là EDTA) để bảo vệ tế bào tránh khỏi sự phân hủy của các enzyme nội bào, (4) Tiếp tục sử dụng các hóa chất như chloroform, isoamyl alcohol… để loại protein và các tạp chất. (5) Thu hồi DNA bằng cách kết tủa trong cồn ho c isopropanol…Sau đó ly tâm, thu tủa DNA và hòa tan DNA trong nước cất ho c dung dịch đệm được dung dịch DNA để bảo quản.
DNA sau khi tách chiết có thể kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo quang phổ ho c điện di. Để đánh giá độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ người ta đo dung dịch DNA thu được ở bước sóng 260 nm (phổ hấp phụ cực đại
35
trong khoảng 1,8 đến 2,0 thì có thể xem dịch chiết DNA đã tinh sạch. Để đánh giá mức độ tinh sạch, nguyên vẹn của phân tử DNA bằng phương pháp điện di thì cần thiết phải có gel agarose. Các bản gel đóng vai trò như các tấm lưới để các phân tử DNA vượt qua. Sau khi điện di, các phân tử DNA sẽ được hiện hình bằng cách nhuộm với thuốc thử ethidium bromid. Thuốc thử này tạo liên kết với các base nito, do vậy khi chiếu tia UV ở bước sóng khoảng 300 nm, phần có DNA sẽ phát quang màu da cam. Nếu phổ điện di của dung dịch DNA cho hình một dải băng rộng, ho c gồm nhiều vạch thì chứng tỏ DNA bị đứt gãy nhiều ho c còn lẫn tạp chất. Phố điện di là một băng gọn, rõ chứng tỏ DNA là không bị đứt gãy và đảm bảo độ tinh sạch.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của các
mẫu cây thuốc lá theo phương pháp của Saghai-Maroof và đtg (1984) như mô tả
trọng mục 2.3.4.1[28].
Chúng tôi chọn 14 cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0 sau 3-4 tuần ra cây có biểu hiện sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện nhà lưới. Các dòng cây được chọn ký hiệu là T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12, T0-13, T0-14 và cây thuốc lá không chuyển gen (cây WT) để
tách chiết DNA tổng số và kiểm tra sự có m t của gen chuyển AcF3’5’H trong cây
chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. DNA tổng số từ các mẫu lá được tách chiết và điện di kiểm tra trên gel 0,8% (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh kết quả điện di DNA tổng số
(1-14: DNA tổng số của các dòng cây thuốc lá chuyển gen ĐC: là mẫu cây WT)
Kết quả trên hình 3.5 là DNA của 14 mẫu cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và mẫu cây đối chứng (WT). Sau khi điện di DNA tổng số, kết quả cho thấy chỉ có
36
một bằng chính tương đối sáng và rõ nét tập trung các phân tử DNA. Điều này chứng tỏ, DNA tách chiết từ các mẫu cây thuốc lá nghiên cứu tương đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sủ dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.