3. Nội dung nghiên cứu
3.3.2. Kết quả nhân gen AcF3’5’H bằng kỹ thuật PCR
Tiến hành phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu F3’5’H-NcoI-F và F3’5’H-
NotI-R (bảng 2.4) nhân bản đoạn gen AcF3’5’H từ DNA hệ gen của 14 dòng cây thuốc lá T0, kết quả thể hiện ở hình 3.6.
Hình ảnh điện di ở hình 3.6. cho thấy, có 6 dòng cây gọi là dương tính với PCR, biểu hiện ở làn chạy số 2, 4, 6, 10, 12, 14. vì trên gel điện di xuất hiện một đoạn DNA duy nhất, có kích thước 1,5 kb, tương ứng với kích thước dự kiến của gen
chuyển AcF3’5’H (1536 bp). Ngược lại, các làn chạy số 1, 3, 5, 7, 8, 9,11, 13 không
xuất hiện băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ không có gen AcF3’5’H
được chuyển vào.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen AcF3’5’H từ các cây thuốc lá chuyển gen T0.
1-14: Các dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0; M: Thang chuẩn DNA 1kb; WT: Cây thuốc lá không chuyển gen; (+): Sản phẩm PCR từ cấu trúc chuyển gen
pCB301_AcF3’5’H
Như vậy, kết quả phân tích ban đầu có thể dự đoán rằng cấu trúc mang gen
chuyển pC301_AcF3’5’H có thể đã được dung hợp vào hệ gen cây thuốc lá.
Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn phân tích kết quả PCR xác nhận được 6/90 cây T0 dương tính với PCR, đạt hiệu suất chuyển gen 6,67%. Các cây chuyển gen
37
dương tính với PCR ở giai đoạn T0 ký hiệu là T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T0- 14 tiếp tục được theo dõi ngoài vườn ươm để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích sinh vật chuyển gen là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện ở các phòng thí nghiệm. Gen chuyển là các gen đã biết, kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy chỉ cần: Tách chiết DNA genome của sinh vật chuyển gen; sử dụng c p mồi đ c hiệu của gen để khuếch đại bằng phản ứng PCR; Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose. Nếu sản phẩm PCR có kích thước đúng như dự kiến thì mẫu phân tích được coi là dương tính, đồng nghĩa với chuyển gen thành công. Tuy nhiên, kết quả PCR dương tính cũng có thể (1) vi khuẩn mang gen chuyển còn tồn tại trong khối mô hay trong gian bào của mẫu phân tích; (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính; (3) gen chuyển không hoạt động, tức là không được biểu hiện thành protein có chức năng sinh học... Do đó, phân tích sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật PCR chỉ mới có giá trị định hướng ban đầu cần thiết phải được nghiên cứu nhiều hơn để kết quả tạo sinh vật chuyển gen được công nhận.
3.4. ết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0
Sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 được
đánh giá bước đầu bằng kỹ thuật RT-PCR. Sự biểu hiện gen đang ở mức phiên mã (tạo ra RNA). Kết quả phân tích trình bày trên hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả RT-PCR khuếch đại gen AcF3’5’H
(cDNA) từ các cây thuốc lá biến nạp.
M: thang DNA 1kb; WT: Cây thuốc lá không biến nạp; (+): Vector pCB301_AcF3’5’H; 1-6 các cây thuốc lá được biến nạp gen AcF3’5’H ở thế hệ T0 tương ứng T0-2, T0-4, T0-6, T0-10, T0-12, T0-14
Hình ảnh điện di ở hình 3.7. cho thấy, có 3 dòng cây gọi là dương tính với RT- PCR, biểu hiện ở làn chạy số 2, 3, 6, tương ứng với kích thước dự kiến của gen
38
chuyển AcF3’5’H (1,581 bp). Ngược lại, các làn chạy số 1, 3, 5, 7 không xuất hiện
băng vạch có kích thước mong muốn, chứng tỏ gen AcF3’5’H không được biểu hiện
ở thế hệ T0.
Hiệu suất biến nạp gen ở giai đoạn phân tích kết quả RT-PCR xác nhận được 3/90 cây T0, đạt hiệu suất chuyển gen 3,33%. Các cây chuyển gen dương tính với RT-PCR ở giai đoạn T0 ký hiệu là T0-4, T0-6, T0-14 tiếp tục được theo dõi ngoài vườn ươm để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
39
ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ Kết luận:
1. Cấu trúc của vector trúc pC301_AcF3’5’H gồm có hai phần: (1) Phần mang gen nptII mã hóa amino glycosid 3’phosphotransferase có tính đối kháng với kháng sinh
thuộc nhóm amino glycosid và (2) Phần mang gen AcF3’5’H mã hóa flavonoid 3' 5'
hydroxylase phân lập từ cây Ô đầu.
2. Biến nạp cấu trúc pC301_AcF3’5’H nhờ vi khuẩn A. tumefaciens vào mô lá cây
thuốc lá K326 trong điều kiện có nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 0,6 – 0,8. Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamicin 50 mg /l và cefotaxime 40 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 67,77%. Ra rễ cây trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 86,88%, chất lượng rễ tốt. Cây con đưa ra ngoài vườn ươm trồng trên giá thể sau 4 tuần có tỷ lệ sống đạt 66,66%.
3. Xác định sự có m t của gen chuyển AcF3’5’H vào mô lá thuốc lá K326 nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens đã được xác định được 6/90 cây T0 dương tính với PCR, đạt
hiệu suất chuyển gen 6,67%.
4. Xác định sự biểu hiện của gen chuyển AcF3’5’H bằng kỹ thuật RT-PCR đã xác
định được 3/90 cây T0 dương tính với RT- PCR, hiệu suất biến nạp gen 3,33%.
Kiến nghị:
Tiếp tục đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở mức độ protein bằng các kỹ thuật như Western ho c ELISA.
40
TÀI LIỆU THAM HẢO Tiếng Việt:
1. Bộ môn cây công nghiệp Trường Đại học nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,
Giáo trình giảng dạy cây thuốc lá, Nxb Thành Phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Thị Ngọc Lan, Từ Quang Tân, Chu Hoàng Mậu (2020), Sinh học hiện
đại-một số vấn đề về nguyên lý và ứng dụng, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội.
3. Phutthakone Vaciaxa, Trần Thị Hồng, Phạm Thị Thanh Nhàn, Vũ Thị Thu
Thủy, Chu Hoàng Mậu (2021), “Nghiên cứu biến nạp gen GmDREB6 thông
qua Agrobacterium tumefaciens ở giống đậu tương”, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ Đại học Thái Nguyên. 226(01), pp. 57-64.
4. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật và ứng
dụng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
5. Vì Th Đại học Thái Nguyên.và ứng dụng), ái Nguyênterium tumefaciens ở
giống đậu tương.ốt. phục vụ cho các nghiên cứu tiếpnhờ Agrobacterium
tumefaciens”, T,ien của nsm Thái Nguyên.và ứng dụng), ái Nguyên. 19(8). pp:39-42
6. Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp (1996), Trồng và chế biến thuốc lá, Nxb
Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Lê Thị Hồng Trang, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Hữu Quân (2019), “Chuyển gen
glycine max chanlcone isomerase 1A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacteriem tumefaciens: một mô hình cho tăng cường biểu hiện gen
GmCHI1A ở cây đâu tương”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái
Nguyên, 207(14), pp: 195-200.
8. Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng,
Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đ c điểm của gen GmCHI phân lập từ
một số giống đậu tương khác nhau về hàm lượng Isoflavone”, Tạp chí Sinh học.
41
Tiếng Anh:
9. Akehurt B. C. 1981: Tobacco. Longman group Ltd., New York. 764 pp.
10. Chyi, Y. S., Jorgensen, R. A., Goldstein, D., Tanksley, S. D., Loaiza-Figueroa, F.
(1986). Locations and stability of Agrobacterium-mediated T-DNA insertions in the
Lycopersicon genome.Molecular and General Genetics MGG, 204(1), pp: 64-69.
11. Collins W. K., Hawks S. N. Jr.: Principles of the Flue - cured Tobacco
Production. N. C. State University 2nd Ed. 1993. 300.
12. Davis D. L., Nielsen M. T. (1999): Tobacco Production, Chemistry and
Technology. B Blackwell Science. 467.
13. Do, T. L. (2004), "Viet Nam medicinal plants and medicine taste." (2004): 833.
14. Ehlting J., Shin J. J. K., Douglas C. J. (2001), Identification of 4-
coumarate:coenzyme A ligase (4CL) substrate recognition domains, Plant J,
27, pp. 455 - 465.
15. Gracia Zabala1, Jijun Zou1, Jigyasa Tuteja1, Delkin O Gonzalez1,Ishiguro K.,
Taniguchi M., Tanaka Y. (2012), Functional analysis of Antirrhinum kelloggii flavonoid 3'-hydroxylase and flavonoid 3',5'-hydroxylase genes; critical role in
flower color and evolution in the genus Antirrhinu, Plant Res . 125, pp. 451-
456; doi: 10.1007/s10265-011-0455-5.
16. Harborne, J. B., Williams, C. A. (2000). Advances in flavonoid research since
1992. Phytochemistry, 55(6), 481-504.
17. IshiguroK., Taniguchi M., Tanaka Y. (2012), “Functional analysis of
Antirrhinum kelloggii flavonoid 3' hydroxylase and flavonoid 3',5' hydroxylase
genes; critical role in flower color and evolution in the genus Antirrhinu” Plant
Res . 125, pp. 451-456; doi: 10.1007/s10265-011-0455-5.
18. Jaiwal P. K., Kumari R., Ignacimuthu S., Potrykus I., Sautter C. (2001),
Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in mungbean (Vigna radiata L. Wilczeck) -a recalcitrant grain legume, Plan Sci ., 161(2), pp. 239-247.
19. Kim S.Y., 1, Cheon K.S., Im S.M., Kwon O.H., Yoo B.Y, Kim MS., Lee S.Y.
(2016), Isolation and Expression Pattern of Flavonoid 3',5'-hydroxylase Gene in
Clematis patens, Flower Research Journal 24, pp.205-211; DOI :
42
20. L. D. Vu (2014), Research on chemical compositionand some biological effects
of A. acarmichaeli Debx. Planted in Ha Giangprovince, PhD thesis of
Traditional Pharmacy, Institute of Medicinal Materials.
21. Mahalakshmi S.L., Leela T., Manoj K.S (2006), Enhanced genetic efficiency of
mungbean by use of primary leaf explants, Curr. Sci. 91(1), pp. 93-98
22. Nguyen Thi Ngoc Lan., Phutthakone Vaciaxa., Lo Thi Mai Thu., Nguyen Thi
Hai Yen., Pham Thi Thanh Nhan., Le Van Son., Chu Hoang Mau (2019), Design of Construct Carrying GmDREB6 to Eenhance Soybean Gene
Expression Related to Abiotic Stress Response, European Journal of
Engineering Technology Research. 4(6), pp. 135-139.
23. Pal, M., Ghosh, U., Chandra, M., Pal, A., Biswas, B. B. (1991). Transformation
and regeneration of mung bean (Vigna radiata).Indian journal of biochemistry
& biophysics, 28(5-6), pp:449-455.
24. Phogat S.K., Karthikeyan A.S (1999), Generation of transformed calli of Vigna
radiata by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, J Plan Biol.,
26(1), pp. 77-82.
25. Potjamarn, S. (2002). Introduction and expression of cholesterol oxidase gene
in a bacterium [Escherichia coli M15 (pREP4)] and mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]. PhD Thesis, Suranare University of Techonology, pp: 162.
26. Q. H. Nguyen., H. T. T. Hoang., H. T. Tran., T. T. T. Vu., T. D. Sy., M. H.
Chu., L. T. N. Nguyen (2020), In vitro multiple shoot regeneration and hairy root induction of Aconitum carmichaelii Debex.-an important medicinal plant,
SYLWAN, vol. 164, pp. 228-242.
27. Reed S.M (1993), Use of stomatal size to distinguish between haploid and
dihaploid tobacco plants, Tobacco Scienes. 37, pp. 84-86.
28. Saghai-Maroof, M. A., Soliman, K. M., Jorgensen, R. A., Allard, R. W. (1984),
Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian
inheritance, chromosomal location and population dymnamics, Proc. Natl.
43
29. Tazeen, S., Mirza, B. U. S. H. R. A. (2004). Factors affecting Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Vigna radiata (L.) Wilczek. Pak. J. Bot, 36(4), 887-896..
30. Seitz, C., Ameres, S., Schlangen, K., Forkmann, G., Halbwirth, H. (2015).
Multiple evolution of flavonoid 3′, 5′-hydroxylase. Planta, 242(3), 561-573.
31. Solis, J., Medrano, G., & Ghislain, M. (2007). Inhibitory effect of a defensin
gene from the Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora
infestans. Journal of plant physiology, 164(8), pp: 1071-1082.
32. Tso, T. C. (1990): Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant.
IDEALS, Inc. USA. 753 p.
33. Veluthambi, K., Gupta, A. K., Sharma, A. (2003). The current status of plant
transformation technologies. Current Science, 84(3), pp: 368-380.
34. Wang, Y. S., Xu, Y. J., Gao, L. P., Yu, O., Wang, X. Z., He, X. J., ... Xia, T.
(2014). Functional analysis of flavonoid 3′, 5′-hydroxylase from tea plant
(Camellia sinensis): critical role in the accumulation of catechins. BMC plant
biology, 14(1), 1-14.
35. Zhao-Shi Xu, Ming Chen, Lian‐ Cheng Li.,You‐ Zhi (2011), “ Functions and
application of the AP2/ERF transcription factor family in crop improvement F”. Journal of integrative plant biology, 53(7), 570-585.
Trang Web 36.http://commons.wikimedia.org/wiki/Họ_Cà (11/01/2021) 37. http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/bai-bao-cao-cay-thuoc-la.416576.html (19/01/2021) 38. https://amp.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thuocla.htm (15/02/2021) 39. https://www.vinmec.com/vi/thong-tin-duoc/su-dung-thuoc-toan/phan-loai-va-co- che-tac-dung-cua-khang-sinh/ (12/03/2021) 40. https://vi.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium_tumefaciens (22/03/2021) 41. https://hocday.com/li-cm-n-trc-ht-ti-xin-by-t-lng-bit-n-chn-thanh-va-su-sc-ti- pgs.html?page=3 (14/09/2021)