Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ tế bào nhƣ:
+ Phƣơng pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền nhƣ bột thuỷ tinh, cát thạch anh, đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá ở áp suất cao 55MPa
+ Phƣơng pháp vật lý nhƣ dùng sóng siêu âm
+ Phƣơngng pháp hoá học nhƣ dùng các loại dung môi, butylic, aceton, glycerol, ethylacetate … và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thƣờng chứa mỡ.
Phƣơng pháp cơ học thƣờng ảnh hƣởng đến các thành phần tế bào. Vì vậy thƣờng kết hợp các phƣơng pháp hóa học với phƣơng pháp vật lý:
- Vi khuẩn gram dƣơng (Bacillus, Micrococcus, Steptococus): dùng enzyme
lysozyme phá hủy vách tế bào, ủ với lysozyme từ trứng gà (0.2 mg/ml) ở 37oC trong 15 phút.
- Vi khuẩn gram âm (E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) rửa tế bào với
detergent (0.1%(v/v) N-lauroyl-sarcosine), xử lý với với sucrose (0.7 M), Tris (0.2 M),
Trang 55
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
DNA có trong dịch chiết có có độ nhớt cao gây khó khăn trong việc tinh sạch enzyme. Có thể xử lý bằng deoxyribonuclease 1 (10 μg/ml) hoặc với protamine (protein giàu arginine trong cấu tạo) hoặc xửlý polymer tích điện dƣơng (polyethyleneimine).
Để chiết tách các enzyme màng, màng tế bào cần đƣợc xử lý với non-ionicdetergent
nhƣ Triton hay Tween. Các deetergent này ít gây ảnh hƣởng lên cấu trúc protein nói chung
và enzyme nói riêng. Quy tắc sử dụng detergent: 2 mg detergent dùng cho 1 mg màng tế
bào.
Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý:
- Trƣớc hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5ºC).
- Các thao tác phải nhanh.
- Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme nhƣ NaCl, ZnCl2, CaCl2.
Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phƣơng pháp dùng khi chiết rút. Ví dụ nhƣ nếu dùng máy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng. Nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng. Vì vậy cần dùng chất điện ly thích hợp. Ví dụ khi chiết rút amylase, nếu cho thêm
NaCl 0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút thì hiệu suất chiết rút tăng lên 30%. Ngƣời ta còn nhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% sẽ làm cho kết tủa enzyme tốt hơn và cấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn.
- Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tƣợng động, thực vật, có trƣờng hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hƣởng đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt độ enzyme. Trong trƣờng hợp này ngƣời ta còn cho thêm vào chất khử để loại màu. Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của chlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp.