Từ năm 1963, Bernfeld và Wan đã mô tả phƣơng pháp nhốt (entrapment) các enzyme (trypsin, papain, amylase và ribonuclease) trong gel polyacrylamide.
- Ƣu điểm của phƣơng pháp này là không kết hợp trực tiếp enzyme vào giá thể hay chất mang, mà có thể hình dung nhƣ là enzyme bị bẫy trong các mắt lƣới của lƣới (hình 5.1. b), nên cấu trúc của enzyme không bị biến đổi nhiều.
Trang 126
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
+ Các cơ chất phân tủ lớn (protein, acid nucleic) không đi quamàng đƣợc, vì vậy đốỉ với các enzyme nhƣ protease, nuclease không dùng phƣơng pháp này.
+ Trong một số trƣờng hợp, kích thƣớc của các mắt lƣới cũng khó điều chỉnh thật đồng nhất, do đó enzyme cũng có thể thoát ra một phần.
+ Một số gốc tự do đƣợc tạo thành trong quá trình trùng hợp có thể kìm hãm enzyme.
Vì vậy, cần lựa chọn điều kiện về pH, nhiệt độ và các điềƣ kiện khác của quá trình trùng hợp sao cho ít ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme, kích thƣớc các mắt lƣới (nơi giữ enzyme) đủ bé để enzyme khó bị thoát ra ngoài khi sử dụng, nhƣng cũng phải đủ lớn để cơ chất có thể khuếch tán vào đến enzyme, và sản phẩm đƣợc tạo thành có thể khuếch tán ra khỏi mắt lƣới.
- Để chuẩn bị chế phẩm theo phƣơng pháp này, có thể thực hiện theo các cách sau: + Đƣa enzyme vào gel bằng cách trùng hợp gel trong dung dịch có enzyme ở nồng độ cao, việc trùng hợp nhờ tác dụng của các hóa chất (gel polyacrylamide, polymer tự nhiên nhƣ alginate, gel K-carrageenan); nhờ bức xạ (gel polyvinyl alcohol, pyrrolidone); hoặc nhờ ánh sáng (polyethylen glycol dimetacrylate).
+ Đƣa enzyme vào các sợi: cho hỗn hợp có chứa các thành phần để trùng hợp và E đi qua mắt lƣới, sẽ tạo đƣợc các sợi có gắn enzyme; hoặc cũng có thể cho dung dịch E đi qua sợi rỗng, sợi có lỗ, tạo điều kiện thuận lợi để gắn enzyme vào.
Để thực hiện phƣơng pháp này có hiệu quả, cần nắm vững các điều kiện trùng hợp để có thể dễ dàng đạt đƣợc gel đúng theo yêu cầu.
Các chất có thể dùng để tạo gel trong phƣơng pháp này là các chất có cấu tạo mắt lƣói nhƣ: gelatin, alginate (polysaccharide của tảo), agarose, polyacrylamide, hoặc các prepolymer tổng hợp.
Tùy mục đích sử dụng, có thể cắt gel (đã đƣợc trùng hợp có chứa enzyme) thành từng lớp mỏng, từng mẫu nhỏ hay từng hạt (gel đã đƣợc loại nƣớc và nghiền thành hạt) để làm tăng bề mặttiếp xúc của enzyme trong gel với cơ chất trong dung dịch. Sau đây sẽ nêu chi tiết hơn vế một số các chất đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp này.
Trang 127
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
Alginate (acid alginic) là acid polyuronic tách từ rong biển, bao gồm các đơn vị cấu tạo của các acid D- mannuronic và L- guluronic kết hợp với nhau bằng liên kết β-1,4
Muối natri của alginate (sodium alginate) là chất hòa tan trong nƣớc, do đó có thể trộn với enzyme trong dung dịch, sau đó thêm từng giọt dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành gel calcium alginat không tan có chứa enzyme. Phƣơng pháp này đƣợc dùng khá rộng rãi vì khá đơn giản và alginate cũng dễ tìm.
5.2.3.2.K-carrageenan, tạo gel K-carrageenan – enzyme không tan
K-carrageenan là hỗn hợp các polysaccharide tƣơng tự agar-agar, tách từ tảo đỏ, hòa tan trong nƣớc hoặc trong dung dịch muối, có khoảng 4-5% carragenin, là polysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate:
Nguyên tắc: thêm từ từ dung dịch chất tạo gel (potasium chloride, hoặc các cation khấc nhƣ ammonium, alcium, aluminum) vào dung dịch muối k-carrageenan có chứa
enzyme, sẽ nhận đƣợc chế phẩm enzyme không tan. Glutaraldehyde và
hexamethylenediamine có tác dụng làm cho gel cứng hơn và enzyme đƣợc giữ trong gel bền hơn. Theo Chibata và cộng sự, k-carrageenan là nguyên liệu tốt để cố định tế bào vi sinh vật dùng trong công nghiệp sản xuất nhiều chất khác nhau.
5.2.3.3.Polyacrylamide, tao gel polyacrylamide – enzyme không tan
Trang 128
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
(Bis) trong dung dịch có chứa enzyme, và một số yếu tố cần thiết cho quá trình trùng hợp (TEMED, potassium persulfate, hình 5.2):
Hình 5.2. Các phản ứng trùng hợp gel polyacrylamide từ các monomer trong dung dịch có enzyme để tạo chế phẩm enzyme không tan (enzyme bị nhốt trong các
mắt lƣỡi)
TEMED: N,N,N’,N’- tetramethylenediamine
5.2.3.4.Các tiền polymer (prepolymer) tổng hợp để tạo các polymer tổng hợp enzyme không tan
Trang 129
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
Quá trình trùng hợp đƣợc thực hiện nhờ ánh sáng (photo-cross-linkable resin pre.polymer): Chuẩn bị dung dịch có prepolymer, enzyme và chất làm tăng độ nhạy thích hợp nhƣ benzoylethylether, chiếu tia UV bƣớc sóng dài (long-wave-length UV light, khoảng 360nm) trong vài phút, sẽ tạo thành liên kết chéo giữa các prepolymer, gel đƣợc hình thành, nhốt enzyme trong các lỗ gel. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để cố định tế bào nấm men sản xuất ethanol ở quy mô pilot.
Các prepolymer đƣợc dùng có chứa các đoạn có tính chất ƣa nƣớc hay kỵ nƣớc, tùy thuộc chiều dài của các đoạn này, do đó có thể điều chỉnh tính ƣa nƣớc hay kỵ nƣóc của chúng đơn giản hơn. Ví dụ prepolymer urethane:
Khi thay đổi tỷ lệ giữa polyethylenglycol và polypropylenglycol sẽ thay đổi cân bằng tính ƣa nƣớc của gel. Khi trộn prepolymer urethane lỏng với dung dịch nƣớc của enzyme, các prepolymer phản ủng với nhau, tạo thành các liên kết urea nối các phản tử với nhau, giải phóng dioxyde carbon, enzyme bị nhốt trong các mắt lƣới của gel.
- Sử dụng prepolymer tổng hợp có các ƣu điểm sau:
+ Chất tiền polymer (prepolymer) không chứa monomer, nên loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của chúng đến phân tử enzyme.
+ Có thể tạo các gel có kích thƣớc của các mắt lƣới theo yêu cầu bằng cách sử dụng các prepolymer có chiều dài mạch thích hợp.
+ Có thể tạo gel có các tính chất hóa lý thích hợp (ví dụ cân bằng giữa tính ƣa nƣớc –kỵ nƣớc) một cách dễ dàng bằng cách tiến hành các thí nghiệm lựa chọn các prepolymer thích hợp trƣớc khi sử dụng để trùng hợp vói enzyme.