Để xác định xem protein đƣợc chiết tách ra có phải là enzyme tinh khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những tính chất vật lý của protein.
- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly
tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhƣng có cùng trọng lƣợng phân tử và có hình dạng tiểu phân (hoặc có khi có sự bù phụ của các ảnh hƣởng của khối lƣợng và hình dạng) thì có hằng số lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độ nhƣ nhau và cho một đỉnh chung.
- Điện di: là phƣơng pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzyme và cũng là phƣơng pháp để xác định sự tinh khiết củ các chế phẩm protein. Gần đây, phƣơng pháp này đƣợc áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzyme cuối cùng.
Phƣơng pháp này rất hiệu quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt đƣợc những protein giống nhau về khối lƣợng phân tử. Dung dịch enzyme khi đƣợc điện di chỉ thấy xuất hiện vạch cân đối tại vị trí có khối lƣợng phân tử nhƣ dự đoán thì đó là dấu hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhƣng khi hàm lƣợng những protein tạp nhỏ (≤ 1%) thì khó phát hiện ra đúng.
- Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặc trƣng cùng hàm lƣợng các nhóm ngọai đặc hiệu.
Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme (cũng nhƣ protein khác) là kết hợp sự phân tích điện di không biến tính và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch.
Thƣờng để xét độ thuần nhất của enzyme, ngƣời ta dựa trên sự so sánh những kết quả thu đƣợc từ một vài phƣơng pháp khác nhau.
Trang 65
TS. BÙI XUÂN ĐÔNG –TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khi bảo quản trong các dung dịch ở 4ºC đều nhanh chóng mất hoạt tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thƣờng thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế.