Quá trình hấp thụ các bức xạ khả kiến và tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân tử gắn liền với kích thích điện tử từ một orbital bền chuyển sang một orbital khơng bền. Đối với phần lớn những biến đổi này, ta khơng thể biểu diễn chính xác cấu trúc của trạng thái kích thích bằng các liên kết thơng thường, bởi vì điện tử ở trạng thái kích thích khơng ở vào một orbital bình thường nào cả. Khi điện tử ở trạng thái cơ bản E1 chuyển sang trạng thái kích thích E2 thì kèm theo biến thiên năng lượng quay và dao động phân tử. Thơng thường khơng thể phân giải các băng (dải) hấp thụ thu được đến mức cĩ thể thấy rõ cấu trúc tinh vi do sự chuyển dịch dao động quay gây ra. Vì vậy các băng hấp thụ do kích thích điện tử là tương đối rộng [111, 112].
- Chế độ đo Blank: dung mơi là nước cất được cho vào cuvet, đo chế độ Blank. - Chế độ đo mẫu: thay cuvet dung mơi bằng cuvet chứa dung dịch pha mẫu 4-NP, NaBH4, đo ở chế độ quét bước sĩng cực đại từ 800 nm xuống 200 nm.
- Mẫu trước khi đo được pha lỗng 8,10 hoặc 20 lần tùy thuộc độ đậm và độ màu của chất pha mẫu sao cho nồng độ < 10-3 M để giá trị độ hấp phụ quang nhỏ hơn 1,5.
- Giá trị bước sĩng cực đại của 4-NP đo ở 317 nm và trong mơi trường kiềm cĩ dạng 4-NP- nên đo ở bước sĩng cực đại 400 nm.
- Độ chuyển hĩa tính theo cơng thức:
Độ chuyển hĩa = (1-A)/Ao
Trong đĩ:
A: độ hấp phụ quang của 4-NP- tại thời điểm đo Ao: độ hấp phụ quang của 4-NP- tại thời điểm ban đầu
Mẫu được đo trên máy UV-Vis của hãng Agilent tại phịng thí nghiệm Viện Kỹ thuật Hĩa học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
2.6.11. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tách, trong đĩ pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hố học với các nhĩm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ [117].
Khi chạy sắc ký, quá trình hấp phụ và giải hấp liên tục xảy ra, từ lúc nạp chất mẫu vào cho đến lúc các chất đi ra khỏi cột sắc ký, trong cột tách luơn luơn cĩ 3 tương tác:
- Tương tác pha tĩnh với chất phân tích, cĩ lực F1. - Tương tác pha động với chất phân tích, cĩ lực F2. - Tương tác pha động với pha tĩnh, cĩ lực F3.
Trong 3 tương tác này: F3 là khơng đổi (trong 1 hệ pha), F1 và F2 ngược chiều nhau, F1 giữ chất phân tích lại trên pha tĩnh, F2 kéo chất phân tích vào pha động.
Lực lưu giữ các chất trong quá trình sắc ký F = (F1 + F2 + F3)
Do đĩ trong một hỗn hợp mẫu, chất nào cĩ lực F nhỏ nhất sẽ ra khỏi cột tách trước tiên, chất nào cĩ lực F lớn nhất sẽ ra sau cùng.
dựa trên đường chuẩn.
Các mẫu sản phẩm được định lượng 4-AP bằng phương pháp HPLC với các thơng số kỹ thuật và điều kiện vận hành như sau:
- Dung mơi: + Dung dịch Na2HPO4 1,79 % (DD 1): Hồ tan 45 g Na2HPO4.12H2O trong 1000 mL nước.
+ Dung dịch KH2PO4 0,88 % (DD 2): Hồ tan 8,8 g KH2PO4
trong 1000 mL nước.
+ Dung dịch Tetrabutylamonium bromid 49 %: Hồ tan 4,9 g Tetrabutylamonium bromid trong 10 mL nước.
+ Dung dịch 0,46 % Tetrabutylamonium bromid 49 % trong Methanol (DD 3): Pha lỗng 4,6 mL dung dịch Tetrabutylamonium bromid 49 % với methanol vừa đủ 1000 mL. - Điều kiện sắc ký: + Cột C8 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm). + Nhiệt độ cột: 35 oC. + Tốc độ dịng: 1,5 mL/phút. + Thể tích tiêm: 20 μL. + Bước sĩng phát hiện: 245 nm. + Pha động: DD 1 : DD 2 : DD 3 (375 : 375 : 250).
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn p-AP vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30 mL MeOH, siêu âm hồ tan hồn tồn, bổ sung vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều. Hút chính xác 1,0 mL dung dịch trên vào bình định mức 20 mL, bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch chuẩn đem tiêm.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 mg chế phẩm vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30 mL MeOH, siêu âm hồ tan hồn tồn, bổ sung vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều. Hút chính xác 1,0 mL dung dịch trên vào bình định mức 20 mL, bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch thử đem tiêm.
- Kết quả: hàm lượng p-AP trong mẫu được tính theo cơng thức sau: 𝑎 (%) = 𝑎𝑎 𝑎. 𝑎 . 𝑎 . 𝑎
+ Dt , Dc là độ pha lường của mẫu thử, mẫu chuẩn (mL). + mt, mc là khối lượng của mẫu thử, mẫu chuẩn (mg). + HLc là hàm lượng mẫu chuẩn (%).
Mẫu nghiên cứu được đo tại Trung tâm Kiểm nghiệm, Viện Thực phẩm chức năng.