1.2.1 Nghiên cứu trong nước
Năm 2013, Mai Thị Hiền đã nghiên cứu “Sản xuất trà túi lọc chum ngây và hoa cúc” trong đồ án tốt nghiệp đại học. Trong nghiên cứu Mai Thị Hiền đã xác định thành phần của chum ngây, hoa cúc vàng Việt Nam và đã đƣa ra đƣợc quy trình sản xuất trà túi lọc chum ngây hoa cúc quy mô phòng thí nghiệm [18].
1.2.2 Nghiên cứu ngoài nước
Năm 2005, ZhuShunying và cộng sự đã nghiên cứu thành phần và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu hoa cúc C. morifolium từ 3 mẫu hoa: hoa tƣơi, hoa sấy khô và hoa đã chế biến. Kết quả cho thấy thành phần chính của ba loại tinh dầu là 1,8-cineole,
camphor, borneol and bornyl acetate, nhƣng tỷ lệ các hợp chất này thay đổi rất nhiều do quá trình chế biến hoa. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu từ hoa sấy khô và chế biến trong không khí đƣợc đánh giá chống lại 15 loại vi sinh vật bao gồm ba loại nấm men. Kết quả cho thấy cả hai loại tinh dầu đều có tác dụng kháng khuẩn đáng kể, tuy nhiên, một số khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn giữa hai loại dầu đã đƣợc quan sát đối với một số vi sinh vật, đƣợc cho là do sự thay đổi về tỷ lệ của các thành phần [25].
Năm 2014, Oladipupo A. Lawal và các cộng sự đã nghiên cứu về thành phần của tinh dầu hoa cúc C. morifolium ở Tây Phi. Nghiên cứu đã báo cáo về thành phần tinh dầu hoa cúc thu đƣợc từ quá trình chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc và đƣợc phân tích bằng sác ký khí kết hợp khối phổ GC-MS. Tinh dầu hoa cúc chứa 21 thành phần chiếm 93,7% bao gồm các thành phần chính cis-chrysanthenyl acetate (21,6%), octadecanoic acid (19,5%), borneol (15,5%), camphor (8,7%), α-pinene (8,3%), camphene (6,1%) và 1,8-cineole (6,7%) [26].
Năm 2018, Kuang và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu dễ hoa cúc C. morifolium. Tinh dầu hoa cúc đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp lôi cuốn hơi nƣớc và các thành phần hóa học của nó đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC–MS). Các thành phần chính trong tinh dầu hoa cúc C. morifolium là các hợp chất monoterpen và sesquiterpenes, bao gồm hydrocacbon, ester, andehyde, cetone, phenol và acid hữu cơ, α -curcumene là thành phần lớn nhất (12,55%). Tinh dầu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại 5 chủng đƣợc chọn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritids, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis [27].
Năm 2020, Boukhebti và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cây cúc C. morifolium. Tinh dầu thu đƣợc bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc và xác định thành phần hóa học bằng phƣơng pháp GC- MS. Trong nghiên cứu này xác định 26 hợp chất chiếm 88,40% tổng khối lƣợng tinh dầu. Hợp chất chính là verbenone (17,33%) và các thành phần khác có trong hàm lƣợng đáng kể là: chrysanthenone (9,71%), 4-epi-cubedol (7,25%) và δ-cadinol (05,29%). Tinh dầu của hoa cúc đƣợc chứng minh có tác dụng kháng khuẩn chống lại
vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus ATCC 25923 (35 ± 1,2 mm ) và
Citrobacter
freundii ATCC 8090 (21 ± 0,87 mm), tuy nhiên Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 và Kleibseilla pneumoniae ATCC 700603 [28].
CHƢƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Hóa chất và nguyên liệu
2.1.1.1 Hóa chất
Hóa chất NaCl
Na2SO4
2.1.1.2 Nguyên liệu
Hoa cúc: đƣợc thu hái tại Đồng Tháp Màu sắc: vàng
Mùi: có mùi thơm nhẹ, hƣơng hoa pha chút hƣơng thảo dƣợc Trạng thái: Hoa tƣơi đƣợc thu hát vào sáng sớm
2.1.2 Thiết bị
Khi tiến hành nghiên cứu, sử dụng các thiết bị sau:
Cân kỹ thuật LS320C
Cân phân tích LS 220A
Máy sắc ký khí 6890 N của Agilent (USA) bao gồm bộ tiêm tự động, buồng tiêm, lò cột, đầu dò MS 5972.
Cột HP5 MS (30 m x 0.25 mm x 0.25µm)
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Hoa cúc
Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc Tinh dầu hoa cúc
Xác định tính chất vật lý và thành phần hóa học của tinh dầu
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Thuyết minh sơ đồ
Giai đoạn 1:Khảo sát quá trình trích ly tinh dầu hoa cúc bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Khảo sát quá trình chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc thông qua các điều kiện: thời gian chƣng cất, nồng độ muối (C%), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian xay nguyên liệu, độ giảm khối lƣợng nguyên liệu
Giai đoạn 2: Xác định tính các chất vật lý của tinh dầu hoa cúc và phân tích thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc
Các tính chất vật lý của tinh dầu cần xác định là tỷ trọng và chỉ số khúc xạ
Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc bằng sác ký khí kết hợp khồi phổ GC-MS đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Đại học Khoa học Tự nhiên
2.2.2 Khảo sát quy trình chưng cất
Khảo sát độ giảm khối lƣợng nguyên liệu
Khảo sát thời gian xay Xử lý sơ bộ và tỷ lệ
dung môi:nguyên liệu Nƣớc muối NaCl Khảo sát nồng độ muối NaCl Na2SO4 Hỗn hợp tinh dầu và nƣớc Tách nƣớc và làm khan Tinh dầu
Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát quy trình chƣng cất tinh dầu
Tinh dầu hoa cúc đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc theo Dƣợc Điển Việt Nam IV (2009). Sử dụng thiết bị chƣng cất KOL 2, mẫu nguyên liệu/nƣớc đƣợc gia nhiệt cho đến khi hỗn hợp sôi, hơi nƣớc tạo thành sẽ lôi cuốn tinh dầu đi lên. Hỗn hợp hơi lỏng tiếp tục vào hệ thống làm nguội và ngƣng tụ. Thu hồi
tinh dầu bằng phƣơng pháp bổ sung muối khan Na2SO4 với hàm lƣợng 5% khối lƣợng/thể tích tinh dầu.
Quá trình tách chiết tinh dầu hoa cúc đƣợc mô tả ở Hình 2.2. Mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu sử dụng 200 g hoa cúc tƣơi, dùng dung dịch NaCl làm dung môi, thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai lần lặp lại [47]
2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng độ giảm khối lượng nguyên liệu đến quá trình chưng cất tinh dầu
a) Mục đích
Khảo sát ảnh hƣởng độ giảm khối lƣợng nguyện liệu đến quá trình chƣng cất tinh dầu nhằm lựa chọn đƣợc thời gian xay tối ƣu cho hiệu suất trích ly tinh dầu cao nhất
b) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm này, sẽ đƣợc giữ cố định các thông số thời gian chƣng cất, nồng độ NaCl, thời gian xay, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thay đổi thời gian sấy lần lƣợt là 60, 120, 180, 240 phút.
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng độ giảm khối lƣợng nguyên liệu đến quá trình chƣng cất tinh dầu
Thí TT nghiệm 1 TN1-1 2 TN1-2 3 TN1-3 4 TN1-4 5 TN1-5
c) Thông số đánh giá
Đánh giá ảnh hƣởng của độ giảm khối lƣợng nguyên liệu đến hiệu suất của quá trình chƣng cất dựa vào lƣợng tinh dầu thu đƣợc.
2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xay đến quá trình chưng cất tinh dầu
a) Mục đích
Khảo sát ảnh hƣởng thời gian xay đến quá trình chƣng cất tinh dầu nhằm lựa chọn đƣợc thời gian xay tối ƣu cho hiệu suất trích ly tinh dầu cao nhất
b) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm này sẽ cố định các thông số thời gian chƣng cất, nồng độ NaCl, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian sấy và thay đổi thời gian xay lần lƣợt là không xay, 60 giây, 90 giây
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian xay đến quá trình chƣng cất tinh dầu Thí STT nghiệm 1 TN2-1 2 TN2-2 3 TN2-3 c) Thông số đánh giá
Đánh giá ảnh hƣởng của thời gian xay đến hiệu suất của quá trình chƣng cất dựa vào lƣợng tinh dầu thu đƣợc
2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình chưng cất tinh dầu
Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình chƣng cất tinh dầu nhằm lựa chọn đƣợc tỷ lệ tối ƣu cho hiệu suất trích ly tinh dầu cao nhất
b) Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình chƣng cất tinh dầu
Thí
STT nghiệm
1 TN3-1
2 TN3-2
Thí nghiệm này, sẽ đƣợc giữ cố định các thông số thời gian chƣng cất, nồng độ NaCl, thời gian xay, thời gian sấy và thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lần lƣợt là 1:2, 1:3
c) Thông số đánh giá
Đánh giá ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất của quá trình chƣng cất dựa vào lƣợng tinh dầu thu đƣợc
2.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến quá trình chưng cất tinh dầu
a) Mục đích
Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl đến quá trình chƣng cất tinh dầu nhằm lựa chọn đƣợc nồng độ tối ƣu cho hiệu suất trích ly tinh dầu cao nhất.
b) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm này, sẽ đƣợc giữ cố định các thông số thời gian chƣng cất, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian xay, thời gian sấy và thay đổi nồng độ NaCl (%) lần lƣợt là 0, 5, 10, 15, 20.
Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl đến quá trình chƣng cất tinh dầu
Thí STT nghiệm 1 TN4-1 2 TN4-2 3 TN4-3 4 TN4-4 5 TN4-5 c) Thông số đánh giá
Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến hiệu suất của quá trình chƣng cất dựa vào lƣợng tinh dầu thu đƣợc
2.2.2.5 Khảo sát thời gian chưng cất tinh dầu hoa cúc
a) Mục đích
Khảo sát thời gian chƣng cất tinh dầu nhằm lựa chọn đƣợc thời gian tối ƣu cho hiệu suất trích ly tinh dầu cao nhất
b) Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm này, sẽ đƣợc giữ cố định các thông số nồng độ NaCl, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian xay, thời gian sấy và thay đổi thời gian chƣng cất lần lƣợt là 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 phút.
Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chƣng cất tinh dầu STT Thí nghiệm 1 TN5-1 2 TN5-2 3 TN5-3 4 TN5-4 5 TN5-5 6 TN5-6 7 TN5-7 8 TN5-8 c) Thông số đánh giá
Đánh giá ảnh hƣởng của thời gian chƣng cất đến hiệu suất của quá trình chƣng cất dựa vào lƣợng tinh dầu thu đƣợc
2.2.3 Xác định tính chất hóa lý và thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc
2.2.3.1 Mục đích
Mỗi loại tinh dầu đƣợc đặc trƣng bởi các chỉ số hóa lý nhƣ tỷ trọng (thƣờng so với nƣớc), chỉ số khúc xạ và góc quay cực. Thành phần hóa học của tinh dầu sẽ khác nhau khi đƣợc trồng ở những địa phƣơng khác nhau, điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng cũng nhƣ phƣơng pháp trích ly khác nhau thì thành phần hóa học và tỷ lệ trong tinh dầu sẽ khác nhau. Vì vậy, mẫu tinh dầu thu đƣợc từ điều kiện trích ly tối ƣu sẽ đƣợc xác định tính chất hóa lý và thành phần hóa học.
2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm
a) Xác định tỷ trọng tinh dầu
Tỷ trọng tinh dầu đƣợc xác định tại phòng thí nghiệm Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. Tỷ trọng của tinh dầu so với nƣớc đƣợc thực hiện bằng cách xác định tỷ
số khối lƣợng của 1 mL nƣớc cất (m1) và 1 mL tinh dầu ở cùng nhiệt độ (m2) bằng micropipette và cân phân tích LS 220A.
b) Xác định chỉ số khúc xạ
Chỉ số khúc xạ của tinh dầu đƣợc xác định tại phòng thí nghiệm Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh bằng khúc xạ kế điện tử ABBE, AR2008. Chỉ số khúc xạ đƣợc thực hiện bằng cách nhỏ một giọt tinh dầu lên mặt kính của khúc xạ kế, điều chỉnh sao cho giọt tinh dầu nằm đúng vị trí ánh sang truyền tới, đọc chỉ số khúc xạ trên thiết bị. Chỉ số khúc xạ đƣợc đối chứng với nƣớc ở 25C. Nếu chỉ số khúc xạ của nƣớc trong khoảng 1,3325 – 1,3330, khúc xạ kế có thể tin cậy.
c) Xác định thành phần hóa học
Thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ GC-MS tại Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
2.2.3.3 Thông số đánh giá
a) Tính chất hóa lý
Tỷ trọng và chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc.
b) Thành phần hóa học
Thành phầ hóa học đƣợc xác định thông qua thời gian lƣu và khối phổ của tinh dầu hoa cúc.
2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1 Xác định hiệu suất trích ly tinh dầu
Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly tinh dầu, hiệu suất tinh dầu đƣợc thực hiện ở điều kiện tối ƣu, thí nghiệm đƣợc thực hiện ba lần. Hiệu suất của quá trình chƣng cất tinh dầu đƣợc đánh giá thông qua đại lƣợng thành phần phần trăm thể tích tinh dầu thu đƣợc tính theo khối lƣợng nguyên liệu. Biểu thức tính:
Trong đó:
%H: phần trăm thể tích tinh dầu tính theo khối lƣợng nguyên liệu (mL tinh dầu/100 g nguyên liệu)
Vtd: thể tích tinh dầu thu đƣợc (mL) mnl: khối lƣợng nguyên liệu (g)
2.1.2 Xác định tính chất vật lý của tinh dầu hoa cúc (TCVN)
2.1.2.1 Chỉ số khúc xạ
Mục đích: Chỉ số khúc xạ của một chất so với không khí là tỷ lệ của sin góc tới và sin góc khúc xạ của chum tia sang truyền từ không khí vào chất đó. Chỉ số khúc xạ có giá trị định tính và phát hiện tạp chất. Vì vậy xác định chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc có thể đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của tinh dầu hoa cúc
Chỉ số khúc xạ đƣợc đối chứng với nƣớc ở 25C. Nếu chỉ số khúc xạ của nƣớc trong khoảng 1,3325 – 1,3330, khúc xạ kế có thể tin cậy.
2.1.2.2 Tỷ trọng tinh dầu
Tỷ trọng của tinh dầu đƣợc xác định bằng tỷ số giữa khối lƣợng tinh dầu và khối lƣợng nƣớc cất cùng thể tích ở một nhiệt độ nhất định. Tỷ trọng của tinh dầu so với nƣớc giúp ta xác định đƣợc cách thu tinh dầu sau khi chƣng cất và chọn thiết bị phù hợp.
Tỷ trọng của tinh dầu so với nƣớc đƣợc thực hiện bằng cách xác định khối lƣợng của 1 mL nƣớc cất (m1) và 1 mL tinh dầu ở cùng nhiệt độ (m2).
2.1.3 Phương pháp đánh giá cảm quan và thành phần hóa học
2.1.3.1 Màu sắc và độ trong suốt
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào ống thủy tinh trong suốt, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cƣờng độ của màu và và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu còn vẫn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nƣớc.
2.1.3.2 Mùi và trạng thái
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi loại tinh dầu có một mùi đặc trƣng. Dựa vào mùi có thể biết đƣợc tính chất và mục đích sử dụng của tinh dầu.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20- 30 mm; cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cƣờng độ mùi (thơm dịu, nồng,...).
2.1.3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ GC-MS tại Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
Thông số sắc ký khí cho phân tách mẫu: Nhiệt độ buồng tiêm 280
C Tốc độ khí mang 1,0 mL/phút sử dụng khí He Chế độ tiêm: Split Tỉ lệ chia dòng 50:1 Nhiệt độ đầu dò 150 C Thế ion 1900 EMV
Bảng 2.6 Chƣơng trình nhiệt Tốc độ tăng nhiệt (C/phút)
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu bằng phƣơng pháp lôi cuốn hơi nƣớc
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng độ giảm khối lượng nguyên liệu
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây
Độ giảm khối lƣợng nguyên liệu có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình bảo quản và vận