3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng độ giảm khối lượng nguyên liệu
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây
Độ giảm khối lƣợng nguyên liệu có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình bảo quản và vận chuyển nguyên liệu. Thông qua khảo sát này ta có thể xây dựng quy trình bảo quản, vận chuyển nguyên liệu.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lấy 200 g nguyên liệu tƣơi, sấy ở nhiệt độ 60C với những mốc thời gian khác nhau. Kết quả thu đƣợc ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến độ giảm khối lƣợng nguyên liệu Thí nghiệm
Thời gian
Độ giảm khối lƣợng (g)
Sau khi sấy các mẫu, nguyên liệu đƣợc chƣng cất ở cùng điều kiện. Kết quả thu đƣợc
ở Phụ lục 1
Từ Hình 3.1, ta có thể thấy rằng lƣợng tinh dầu thu đƣợc giảm từ 0,050 đến 0,005 mL khi độ giảm khối lƣợng tăng dần từ 0 đến 132,15 g. Điều này có thể giải thích do một lƣợng tinh dầu sẽ thoát đi trong quá trình sấy. Mặt khác sau khi sấy nguyên liệu sẽ trở nên dẻo vài dai hơn, hơi nƣớc rất khó lôi cuốn tinh dầu theo. Vì vậy để thu đƣợc lƣợng tinh dầu tối đa, ta nên chƣng cất ngay sau khi thu hoạch.
Độ giảm khối lƣợng V T in h dầ u × 10 2 ( m L ) 6 5 4 3 2 1 0 0 Độ giảm khối lƣợng (g) Hình 3.1 Ảnh hƣởng của độ giảm khối lƣợng 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xay
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi
Trong cánh hoa cúc, tinh dầu đƣợc chứa trong các túi, sẽ rất khó để hơi nƣớc lôi cuốn tinh dầu nếu nhƣ không có tác động cơ học làm vỡ các cấu trúc túi đựng tinh dầu. Thông qua khảo sát ảnh hƣởng của kích thƣớc nguyên liệu ta thu đƣợc kết quả Phụ lục 2
Dựa vào Hình 3.2, có thể thấy kích thƣớc nguyên liệu ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình trích ly tinh dầu. Khi để nguyên kích thƣớc cánh hoa, tinh dầu đƣợc bao bọc bởi thành rắn chắc nên hơi nƣớc rất khó phá vỡ cấu trúc đó. Khi đó kích thƣớc nguyên liệu càng nhỏ lƣợng tinh dầu thu đƣợc càng nhiều, vì vậy khi xay ở nguyên liệu ở 60 giây lƣợng tinh dầu thu đƣợc 0,050 mL còn không xay thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc chỉ 0,010 mL. Tuy nhiên khi kích thƣớc nguyên liệu quá nhỏ nguyên liệu sẽ xếp chặc hơn, hơi nƣớc khó có thể đi qua tất cả nguyên liệu và lôi cuốn tinh dầu, có thể thấy rằng xay
ở 60 giây thu đƣợc nhiều hơn khi xay ở 90 giây, lƣợng tinh dầu thu đƣợc tƣơng ứng là 0,055 và 0,040. Vì thế kết quả cho thấy thời gian xay tối ƣu là 60 giây.
(m m ) d ầu T in h
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi và nguyên liệu
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc trong Phụ lục 3
Căn cứ vào Hình 3.3, nhìn chung tỷ lệ dung môi và nguyên liệu không ảnh hƣởng nhiều đến quá trình chƣng cất, ở tỷ lệ 1:2 và 1:3 thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc tƣơng ứng là 0,055 và 0,060 mL. Tuy nhiên lƣợng nƣớc không thể quá ít vì hơi nƣớc giúp phá vỡ các túi tinh dầu giúp lôi cuốn tinh dầu theo, cũng nhƣ không cung cấp đủ hơi để cuốn tinh dầu đi đến ống sinh hàn. Ngoài ra điều kiện tiến hành thí nghiệm không cho phép tổng thể tích dung dịch và nguyện liệu cho vào bình cầu vƣợt quá 2/3 thể tích bình. Vì vậy chọn tỷ lệ 1:3 là tỷ lệ tối ƣu trong phạm vi nghiên cứu này.
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi V T in h dầ u × 10 2 ( m L ) 6.1 6 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 6 5.5 1:2 1:3
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Hình 3.3 Ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc ở Phụ lục 4
Từ kết quả Hình 3.4, có thể thấy lƣợng tinh dầu thu đƣợc phụ thuộc vào nồng độ dung dịch NaCl thêm vào, lƣơng tinh dầu tăng từ 0,020 mL đến 0,055 mL khi tăng nồng độ muối từ 0 đến 10% và lại giảm xuống đến 0,02 mL khi tiếp tục tăng nồng độ muối đến 20%. Thêm muối NaCl vào làm tăng độ điện ly của nƣớc giúp tinh dầu dễ khuếch tán vào trong nƣớc, làm tăng nhiệt độ sôi (hay làm giám áp suất hơi của nƣớc). Tuy nhiên khi chƣng cất với nồng độ lớn hơn, lƣơng tinh dầu thu đƣợc giảm điều này có thể giải thích do khi sử dựng muối ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu bị co lại ngăn cản khuếch tán tinh dầu ra ngoài [6].
6 5 dầ u (m m ) 4 3 T in h 2 1 0 0 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl
3.1.5 Khảo sát thời gian trích ly
Điều kiện khảo sát: Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc trong Phụ lục 5
Dựa vào kết quả Hình 3.5, thời gian chƣng cất càng lâu thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc càng nhiều, lƣợng tinh dầu thu đƣợc gần nhƣ tuyến tính theo thời gian. Nhƣng càng về sau lƣợng tinh dầu thu đƣợc so với thời gian càng ít và lƣợng tinh dầu không còn tăng nữa ở 240 phút với lƣợng tinh dầu tối đa là 0,06 mL. Vì vậy để thu đƣợc lƣợng tinh dầu tối đa thì thời gian chƣng cất tối ƣu là 240 phút.
7 6 (m m ) 5 4 dầ u 3 T in h 2 1 0 0
Hình 3.5 Ảnh hƣởng của thời gian trích ly
3.2 Hiệu suất trích ly tinh dầu
Với điều kiện trích ly tối ƣu, kết quả thể tích tinh dầu thu đƣợc trong điều kiện này đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2. Hiệu suất trích ly tinh dầu đƣợc tính theo công thức 2.1
Bảng 3.2 Kết quả chƣng cất ở điều kiện tối ƣu Thí nghiệm
Khối lƣợng nguyên liệu (g) Thời gian sấy (phút)
Thời gian xay (giây)
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Nồng độ NaCl (%)
Thời gian chƣng cất (phút) Thể tích tinh dầu (mL)
3.3 Tính chất vật lý của tinh dầu hoa cúc
Các yếu tố mà Dƣợc Điển Việt Nam yêu cầu rất nghiêm ngặt đối với tinh dầu thiên nhiên đó là tỷ trọng, chỉ số khúc xạ, góc quay cực riêng.
Tỷ trọng của tinh dầu thƣờng nằm trong khoảng 0,85-0,95 (Có một số tinh dầu nguyên chất nặng hơn nƣớc nhƣ tinh dầu đinh hƣơng, tinh dầu quế,…). Tỷ trọng của tinh dầu có thể thay đổi theo thành phần hóa học của nó. Chỉ số khúc xạ có giá trị định tính và phát hiện tạp chất của tinh dầu. Tinh dầu thiên nhiên thƣờng có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 -1,56.
Tỷ trọng và chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc đƣợc xác định tại Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Tỷ trọng của tinh dầu hoa cúc so với nƣớc ở 25
C là: 0,8845 ± 0,002. Tỷ trọng đƣợc tính theo công thức 2.2 với m1 =0,9175 ± 0,001; m2 = 1,0353 ± 0,001
Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc là: 1,484.
Hoa cúc có tỷ trọng và chỉ số khúc xạ tƣơng đối thấp so với các loại tinh dầu khác.
3.4 Đánh giá cảm quan và thành phần hóa học của tinh dầu
3.4.1 Cảm quan tinh dầu thu được
Tinh dầu thu đƣợc đƣợc thực hiện đánh giá cảm quan theo TCVN 8460 : 2010, kết quả thu đƣợc trong Bảng 3.3
Bảng 3.3 Các tính chất cảm quan của tinh dầu hoa cúc Màu sắc Tinh dầu hoa cúc trong suốt có màu vàng
Khả năng tạo nhũ Tinh dầu hoa cúc có khả năng tạo nhũ kém trong nƣớc, dễ dàng tách ra trong quá trình chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
Mùi Tinh dầu có mùi thơm đặc trƣng của hoa cúc, giống mùi thảo dƣợc
3.4.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng GC-MS
Từ kết bảng 3.4, thành phần tinh dầu hoa cúc chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trực tiếp gồm 32 thành phần. Trong đó thành phần chính là chrysanthenone (27,61%), trans- chrysanthenyl acetate (15,75%), selin-6-en-4 -ol (10,08%), cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%), caryophyllene oxide (3,5%) và một số thành phần chiểm tỷ lệ nhỏ nhƣ β-selinene, β-elemene, longifolene, … Kết quả trên cũng khá tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đây nhƣng có sự chênh lệch về thành phần. Điều này cho thấy rằng hàm lƣợng thành phần trong tinh dầu có sự khác biệt nhau tùy thuộc vào điều kiện địa lý, khí hệu và thổ nhƣỡng, .. của từng vùng canh tác.
Bảng 3.4 Kết quả phân tích thành phần của tinh dầu hoa cúc STT 1 2 3 4 5 6 7 8
Hai thành phần cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%) có mặt trong hoa cúc đại đóa vàng C. morifolium, đồng thời cũng là thành phần chính của tinh dầu cây
Artemisia turanica Krasnch từ Iran. Năm 2013, Behravan và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống nấm và gây độc tế bào cytotoxic. Theo nghiên cứu tinh dầu Artemisia turanica chứa 1,8-cineol (40,9%), cis-verbenyl actate (19,0%) và long não (11,0%), chống lại các chủng nấm Trichophyton rubrum,
Trichoderma reesei, Microsporum gypseum và Aspergillus niger đồng thời thể hiện sự ức chế tăng trƣởng khối u (100%) ở nồng độ 0,02% (w/v) và cao hơn [51].
Theo nghiên cứu của Rasoanaivo và các cộng sự tinh dầu thu đƣợc từ quá trình chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc hoa Athanasia brownii (Asteraceae), đã nghiên cứu về thành phần hóa học bằng GC/FID và GC/MS và xác định hoạt tính sinh học, cụ thể là khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng hóa chất, bằng cách xét nghiệm DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2'-azinobis [3 ethylbenzothioline-6-sulfonic acid) và FRAP (ferric giảm khả năng chống oxy hóa), thử nghiệm khuếch tán đĩa và MTT (3- (4, 5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphe- nyltetrazolium bromide). Tinh dầu gồm phần lớn Sesquiterpen oxy (71,2%), với selin-11-en-4 -ol (24,6%), oxit caryophyllene (8,7%), humulene epoxide II (5,1%) và (E) -nerolidol (4,9%). Tinh dầu cho thấy làm giảm hoạt động Streptococci cũng nhƣ có thể trị tận gốc. Tinh dầu có tác dụng ức chế đối với các tế bào ung thƣ ở ngƣời nhƣ A375 (ung thƣ tế bào hắc tố) và HCT 116 (ung thƣ đại trực tràng) với giá trị IC50 là 19,85 và 29,53 mg/ml [50]. Nhận thấy thành phần hoa cúc vàng cũng chứa selin-6-en-4 -ol (10,08%) và caryophyllene oxide (3,5%). Do đó, có thể định hƣớng nghiên cứu về khả năng ức chế tế bào ung thƣ của tinh dầu hoa cúc về sau.
KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ KẾT QUẢ
Tinh dầu hoa cúc C. morifolium đƣợc thu đƣợc bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, với các điều kiện tối ƣu khối lƣợng nguyên liệu 200 g; thời gian sấy 0 phút; thời gian xay 60 giây; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:3; nồng độ NaCl 10%; thời gian chƣng cất 240 phút. Lƣợng tinh dầu thu đƣợc ở diều kiện tối ƣu là 0,055-0,060 mL tƣơng đƣơng với hiệu suất 0,028-0,030% (mL/g).
Tinh hoa cúc C. morifolium, trong suốt có màu vàng, có khả năng tạo nhũ kém trong nƣớc, dễ dàng tách ra trong quá trình chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, mùi thơm đặc trƣng của hoa cúc, mùi tinh dầu dai hơi giống mùi thảo dƣợc. Các chỉ số hóa lý của tinh dầu hoa cúc là: chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc là: 1,484; tỷ trọng của tinh dầu hoa cúc so với nƣớc ở 25C là: 0,8845 ± 0,002.
Bằng phƣơng pháp GC-MS, đã xác định đƣợc 32 hợp chất trong tinh dầu, trong đó thành phần chính là chrysanthenone (27,61%), trans-chrysanthenyl acetate (15,75%), selin-6-en-4-ol (10,08%), cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%), caryophyllene oxide (3,5%) và một số thành phần chiếm tỷ lệ nhỏ nhƣ β-selinene, β- elemene, longifolene. Theo các nghiên cứu trƣớc đây các thành phần này có tác dụng kháng khuẩn , chống nấm và đặc biệt là ức chế các tế bào ung thƣ ở ngƣời.
Tinh dầu hoa cúc C. morifolium có tác dụng ức chế sự phát triển của 4/6 chuẩn vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp trong đó có ba chủng vi khuẩn Gram dƣơng S. pyogenes, S. pneumonia, S. aureu và một vi khuẩn Gram âm H. influenza. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu hoa cúc nằm trong khoảng từ vừa đến mạnh với đƣờng kính vòng kháng khuẩn từ 10 mm trở lên, trong đó khả năng kháng khuẩn cao nhất là S. pyogenes với đƣờng kính vòng kháng khuẩn 24 mm. Bên cạnh khóa luận cũng xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của bốn chủng vi khuẩn kể trên với kết quả khá tốt. Mức độ nhạy của tinh dầu hoa cúc đối với bốn chủng vi khuẩn này khá thấp, hai chủng
vikhuẩn S. pyogene, S. pneumoniae có nồng độ MIC thấp nhất, độ nhạy cao với giá trị là 0,03125%; chủng S. aureu có nồng độ MIC đạt giá trị cao hơn hai chủng trên là 0,0625% và độ nhạy thấp nhất là 0,5% đối với chủng H. influenza.
KIẾN NGHỊ
Trong quá trình thực hiện khóa luận cũng còn nhiều bất cập cũng nhƣ những hạn chế mà đề tài chƣa thực hiện đƣợc. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chƣng cất tinh dầu đƣợc tối ƣu trong khóa luận này chỉ phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm chƣa đƣợc tối ƣu hóa trên thiết bị công nghiệp dung tích lớn. Các yếu tố khó có thể thực hiện trong công nghiệp nhƣ kích thƣớc nghuyên liệu cần phải xay nhỏ nguyên liệu trƣớc khi chƣng cất, sau khi xay cần chƣng cất nhanh chóng vì tinh dầu đã đƣợc phân tán trong nƣớc để quá lâu sẽ bị thất thoát tinh dầu. Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trong khóa luận này đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp trực tiếp, tức nguyên liệu phải tiếp xúc trực tiếp với nhiệt, rất khó kiểm soát nhiệt để nguyên liệu không bị cháy. Vì vậy, các yếu tố này chỉ đƣợc thực hện để nghiên cứu các hoạt tính sinh học của tinh dầu hoa cúc Đại đóa vàng C. Morifolium, chƣa đƣợc thực hiện trên quy mô công nghiệp đem lại giá trị kinh tế. Hy vọng trong tƣơng lai sẽ phát triển đề tài lên quy mô công nghiệp, gáp phần nâng cao giá trị của hoa cúc.
Trong khóa luận chỉ thực hiện khảo hoạt tính kháng khuẩn trên một số dòng gây bệnh về đƣờng hô hấp. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trƣớc đây, trong chi
Chrysanthemum có rất nhiều loài có khả năng kháng khuẩn trên nhiều dòng nhau nhƣ
Escherichia coli, Citrobacter freundii, Shigella sonne, Salmonella enteritids, Bacillus subtilis. Do những hạn chế về thời gian, cơ sở vật chất và một số yếu tố khách quan khác nên trong khóa luận này chƣa thể xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng đó. Định hƣớng tƣơng lai để phát triển đề tài này nghiên cứu chuyên sâu hơn về các chủng vi khuẩn khác ngoài các chủng gây bệnh đƣờng hô hấp. Bên cạnh đó với khả năng kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp, kiến nghị các nghiên cứu về sau đi sâu hơn về ứng dụng của tinh dầu hoa cúc trong các sản phẩm vệ sinh vùng miệng.
Trong khóa luận đã xác định đƣợc hầu hết các thành phần của tinh dầu hoa cúc C. Morifolium. Trong thành phần của tinh dầu hoa cúc có các hợp chất nhƣ chrysanthenone (27,61%), trans-chrysanthenyl acetate (15,75%), cis-verbenyl actate (7,24%), selin-6-en-4 -ol (10,08%) và caryophyllene oxide (3,5%) đã đƣợc nghiên cứu có chứa trong một số loài thực vật khác, có nhiều tác dụng khác nhau nhƣ chống
nấm, chống oxi hóa và đặc biệt là khả năng ức chế các tế bào ung thƣ ở ngƣời. Do khóa luận đƣợc thực hiện trong đợt dịch COVID-19 và một số yếu tố khách quan khác mà khóa luận này chƣa thể đi sâu hơn về các hoạt tính khác của tinh dầu hoa cúc. Hy vọng sẽ đƣợc phát triển nghiên cứu này để xác định các hoạt tính có ý nghĩa trong y học và các ngành liên quan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] N. D. Đoàn, "Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu từ lá cây bạch đàn bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc: Đồ án tốt nghiệp," Trƣờng Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu. Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm, 2016.
[2] M. T. Phạm and T. H. P. G. Vũ, "Nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính