Các phương pháp định lượng IgA, IgG và IgM trong máu và

Nồng độ các chất IgA, IgG và IgM được định lượng thường gắn với các bệnh cụ thể để đánh giá đáp ứng cơ thể trước các tác nhân. Kết quả xét nghiệm nồng độ IgG, IgA và IgM thường được đánh giá cùng nhau. Khi có bất thường nồng độ, điều này gợi ý đã có yếu tố ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch. Xét nghiệm globulin miễn dịch thường không sử dụng để chẩn đoán mà để đánh giá tình trạng bệnh lý cũng như đáp ứng của cơ thể. Ở bệnh nhân HCTH, các globulin miễn dịch này đường được định lượng cùng nhau [76]. Trên lâm sàng thường có một số phương pháp định lượng nồng độ IgA, IgG và IgM.

- Phương pháp miễn dịch đo độ đục: Phương pháp miễn dịch đo độ đục

(turbidity immunoassay) dựa trên nguyên lý kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành PHMD kháng nguyên-kháng thể kết tủa làm thay đổi độ đục của dung dịch. Đo độ đục của dung dịch ở bước sóng xác định. Sự tăng độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ chất cần đo. Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng huyết thanh hoặc huyết tương vào dung dịch phản ứng để tạo phức hợp KN-KT và định lượng bằng phương pháp đo độ đục để xác định lượng kháng thể (kháng nguyên) đã phản ứng có trong mẫu thử. Phương pháp này đã được ứng dụng để định lượng các globuline miễn dịch.

- Phương pháp hoá phát quang miễn dịch: Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

hóa phát quang (Chemiluminescent Immuno Assay: CLIA) dựa trên nguyên lý kháng nguyên (chất có trong mẫu bệnh phẩm) kết hợp với kháng thể (chất có trong thuốc thử) có gắn chất đánh dấu (thường là phân tử Acridinium Ester). Nhờ chất đánh dấu có khả năng phát quang khi thay đổi pH của dung dịch phản ứng và tín hiệu phát quang được khuếch đại qua một ống nhân quang mà người ta có thể định lượng các chất có nồng độ rất thấp hoặc các

chất bất thường trong cơ thể với độ chính xác rất cao so với các kỹ thuật hóa sinh thông thường khác. Phân tử Acridinium ester có trong lượng phân tử nhỏ hơn rất nhiều so với các enzyme trong phản ứng ELISA do đó tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp trung tâm hoạt động của KN và KT do đó độ chính xác tăng đáng kể so với phương pháp ELISA (đặc biệt khi định lượng những chất có nồng độ thấp).

- Phương pháp điện hoá phát quang: Kỹ thuật điện hóa phát quang (ECL:

Electrode Chemi Luminescence) sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh. Công nghệ ECLIA là kỹ thuật hiện đại sử dụng chất đánh dấu là Ruthenium(II)-tris(bipyrrydyl) [Ru(bys)32+] và Tripopylamine (TPA). Khi phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn chất đánh dấu được gắn lên bề mặt điện cực thì quá trình khởi động điện bắt đầu. Dưới tác dụng của dòng điện có điện áp 2V, hợp chất phát ra photon ánh sáng và giải phóng electron quay trở lại bám trên bề mặt điện cực. Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất cần đo. ECLIA đã khắc phục nhược điểm của hóa phát quang (Chemiluminescence) bằng cách sử dụng dòng điện để dễ dàng chuyển phân tử Ruthenium sang trạng thái kích thích do mất electron, ở trạng thái này phân tử Ruthenium phát quang. Do đó điện hóa phát quang có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hóa phát quang. Đặc biệt với nguyên lý cạnh tranh khi sử dụng chất đánh dấu gắn lên chất cần đo (Kháng thể đơn dòng ) đã giúp cho kết quả xét nghiệm sử dụng công nghệ ECLIA có độ chính xác và tin cậy rất cao. Miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng 3 loại nguyên lý như sau: Nguyên lý Sandwich, Nguyên lý cạnh tranh, Nguyên lý bắc cầu (thường áp dụng khi định lượng IgA, IgG và IgM…)

- Phương pháp ELISA: Nguyên lý của kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked

Immunosorbent assay) là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen hoặc kháng thể - antibody đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể - antibody hoặc kháng nguyên cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang. Phương pháp ELISA thường áp dụng trong nghiên cứu, bởi tiêu tốn nhiều thời gian thực hiện. Có 4 phương pháp ELISA như sau:

+ ELISA trực tiếp (direct ELISA): Phương pháp này thường sử dụng trong

ELISA định tính, ít dùng trong định lượng. Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau.

+ ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Ưu điểm của phương pháp này là độ

nhạy cao chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện, quá trình thực hiện xét nghiệm và kéo dài thời gian chẩn đoán.

+ ELISA sandwich: Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ

nhất là độ nhạy cao giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp, phản ứng được thực hiện dễ dàng hơn.

+ ELISA cạnh tranh (competitive ELISA): ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các yếu tố hiện diện trong mẫu với lượng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại.

1.2.4. Phương pháp xác định IgA, IgG và IgM tại mô

Khác với các mô khác, việc xác định có mặt IgA, IgG và IgM cùng bổ thể C3, C1q, các chuỗi kappa và lamda trên mô thận (mảng sinh thiết) có ý nghĩa trong chẩn đoán tổn thương mô bệnh và loại bệnh thận [76]:

- Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang: Miễn dịch huỳnh quang

(ImmunoFluorescense) là phương pháp nhuộm hóa mô giúp phát hiện ra kháng thể ở trong mô hay trong dịch cơ thể. Nguyên lý chung: Dựa trên phản ứng kháng nguyên kết hợp với kháng thể đặc hiệu. Kháng thể sẽ được gắn với chất màu - Fluorochrome. Sau đó tạo thành phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Chất màu sẽ phát ra ánh sáng màu (tùy thuộc vào chất màu được gắn) khi được chiếu tia tử ngoại. Màu xanh táo với FITC (Flourescine isothiocyanate), màu đỏ với TRITC (Tetramethylrhodamin isothiocyanate). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang phát hiện được sự có mặt của IgA, IgG và IgM trong các vị trí của cầu thận, là phương pháp được sử dụng phổ biến trên thế giới, có giá trị chẩn đoán, và chẩn đoán chính xác cao.

- Nhuộm hóa mô miễn dịch: Hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry) là phương pháp được áp dụng phổ biến để xác định các dấu ấn ung thư trên mô. Phương pháp này sử dụng kết hợp hóa chất với phản ứng miễn dịch. Qua đó quan sát sự tồn tại của kháng nguyên (bản chất protein) trong một mô bệnh phẩm. Thông thường, các kháng nguyên này không được thể hiện dưới dạng

một hình thái sinh học có thể quan sát. Hóa mô miễn dịch là phương pháp xác định những kháng nguyên đặc hiệu có trong mô hoặc tế bào, dựa trên sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Cách làm hóa mô miễn dịch là từ mẫu mô đã được đúc trong khối nến của phương pháp giải phẫu bệnh thường quy, được cắt mỏng và nhuộm theo quy trình như sau: Bộc lộ kháng nguyên - ủ với kháng thể thứ 1 - ủ với kháng thể thứ 2 - nhuộm với chất chỉ thị màu (DAB hoặc AEC) - nhuộm Hematoxylin và đọc trên kính hiển vi thông thường. Với mô thận, nếu không có miễn dịch huỳnh quang có thể sử dụng phương pháp này để xác định sự có mặt của IgA, IgG và IgM tại cầu thận. Tuy nhiên, vì đọc kết quả trên kính hiển vi quang học, nên khó phát hiện trường hợp bệnh nhân có các Ig này với số lượng ít trên thận.

- Phương pháp lai tại chỗ: Lai tại chỗ (In situ hybridization- ISH) là phương

pháp lai sử dụng một đoạn ADN, ARN bổ sung hoặc một đoạn axit nucleic đã biến đổi để xác định vị trí của một trình tự ADN hay ARN nhất định trên một phần mẫu mô (tại chỗ). Lai tại chỗ khác với nhuộm miễn dịch huỳnh quang, phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch thường dùng để xác định vị trí của protein trên mẫu mô. Lai tại chỗ là một kỹ thuật hiệu quả để xác định các loại mARN nhất định trong từng tế bào của các mẫu mô. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều bước, cần tối ưu hóa cho từng loại mô và cho mỗi loại mồi sử dụng. Để có thể giữ mARN đích trong các mô, người ta thường sử dụng các chất cố định liên kết chéo (ví dụ như formaldehyde). Ở mô thận, ít dung phương pháp này, bởi phương pháp miễn dịch huỳnh quang cho kết quả rất chính xác, ngay cả khi có một lượng nhỏ IgA, IgG và IgM.

1.3. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài luận án

1.3.1. Nghiên cứu nước ngoài

Hsiao C.C. và cộng sự 2018 [77] nghiên cứu giá trị nồng độ IgG và IgE huyết tương trong chẩn đoán HCTH thay đổi tối thiểu trước khi thực hiện sinh thiết thận. Nghiên cứu được thực hiện trên 142 bệnh nhân có HCTH trong đó

có 38 bệnh nhân chiếm 26,8% HCTH thay đổi tối thiểu và 104 bệnh nhân HCTH không do thay đổi tối thiểu. Tuổi trung bình trong nghiên cứu là 42,1 tuổi, 57,7% là nữ, nồng độ Hb trung bình là 129 g/l, nồng độ ure trung bình là 19,6 mg/dl, creatinine là 0,93 mg/dl, protein là 5,1 g/l, protein niệu 8,7 g/24 giờ, có 2,1% bệnh nhân tiểu máu. Nồng độ IgA trung bình là 287,6 mg/dl, IgG là 681,2 mg/dl và IgM là 187 mg/dl. Nhóm bệnh nhân HCTH do thay đổi tối thiểu có tuổi trung bình thấp hơn, nồng độ Hb cao hơn, protein niệu 24 giờ nhiều hơn, nồng độ IgG thấp hơn nhóm bệnh nhân HCTH không do thay đổi tối thiểu có ý nghĩa, p< 0,01. Tuổi, Hb, nồng độ protein niệu 24 giờ và IgG có giá trị chẩn đoán HCTH thay đổi tối thiểu có ý nghĩa, p< 0,01. Phân tích đa biến cho thấy: tuổi, giới nam, nồng độ Hb, protein niệu 24 giờ và IgG < 450 mg/dl có giá trị tiên lượng độc lập kết hợp HCTH thay đổi tối thiểu.

Siji A. và cộng sự năm 2018 [78] nghiên cứu đặc điểm gen ở bệnh nhi Ấn độ có HCTH kháng corticosteroid. Nghiên cứu thực hiện trên 25 trẻ, có 72% bệnh nhi nam và 28% bệnh nhi nữ. Tuổi trung bình khi phát hiện HCTH là 2,5 tuổi, trong đó có 12% bệnh nhi phát hiện trong thời điểm trẻ 4-12 tháng, 64% bệnh nhi trong độ tuổi 13 tháng đến 05 năm, 16% bệnh nhi từ 06 đến 12 tuổi và 8% tuổi từ 13 đến 18 tuổi. Chức năng thận biến đổi như sau: 16% bệnh nhi bệnh thận mạn tính giai đoạn 2-4, 20% bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối.

Chaves M.M.S. và cộng sự năm 2018 [79] nghiên cứu nồng độ Angiopoietin-2 ở 65 bệnh nhân HCTH. Đánh giá đặc điểm bệnh nhân và lâm sàng cho thấy: tuổi trung bình là 38,1 tuổi, tỷ lệ nam/nữ là 28/37, tổn thương mô bệnh học có 32 bệnh nhân xơ cứng cầu thận ổ đoạn và HCTH thay đổi tối thiểu, 18 bệnh nhân viêm cầu thận màng, 9 bệnh nhân bệnh thận IgA và 4 bệnh nhân viêm cầu thận màng tăng sinh. Nồng độ ure trung bình là 43,4 mg/dl, creatinine là 1,1 mg/dl, MLCT trung bình là 87,3 ml/phút, cholesterol toàn phần là 297,6 mg/dl, LDL-c là 181,4 mg/dl, HDL-c là 56,2 mg/dl, triglycerid là 261,3 mg/dl, protein niệu 24 giờ là 5,9 g.

Nghiên cứu của Iwabuchi Y. và cộng sự năm 2018 trên đối tượng bệnh nhân HCTH phụ thuộc corticosteroid [80]. Mẫu nghiên cứu gồm 51 bệnh nhân trong đó có 32 trẻ em tuổi phát bệnh trung bình là 8,6 tuổi và 19 người lớn tuổi trung bình phát bệnh là 30,6 tuổi, tất cả đều là HCTH thay đổi tối thiểu. Nhóm trẻ em có BMI trung bình là 22,5, albumin máu trung bình là 3,84 g/dl, creatinine 0,69 mg/dl, MLCT là 117 ml/phút, LDL-c là 121 mg/dl, HDL-c là 95,5 mg/dl, Triglycerid là 121 mg/dl, BC là 9,4 G/l, lympho 1,4 G/l, nồng độ IgA trung bình là 227 mg/dl, IgG là 777 mg/dl, IgM là 131 mg/dl. Nhóm bệnh nhân người lớn có BMI 21,9, albumin máu trung bình là 3,6 g/dl, creatinine 0,80 mg/dl, MLCT là 85,2 ml/phút, LDL-c là 142 mg/dl, HDL-c là 84,7 mg/dl, Triglycerid là 165 mg/dl, BC là 9,8 G/l, lympho 1,2 G/l, nồng độ IgA trung bình là 159 mg/dl, IgG là 649 mg/dl, IgM là 124 mg/dl. Chỉ thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về MLCT giữa 2 nhóm bệnh nhi và người lớn.

Zhu H. và cộng sự 2018 [81] đã thực hiện nghiên cứu trên 798 bệnh nhân HCTH trong đó có 47 bệnh nhân HCTH thay đổi tối thiểu và 751 bệnh nhân HCTH do các loại viêm cầu thận khác. Ở nhóm bệnh nhân HCTH thay đổi tối thiểu 22/47 bệnh nhân có tuổi từ 40 trở lên, 30/47 là nam, 7 BN có tăng huyết áp, BMI trung bình là 25, nồng độ albumin trung bình là 22,68 g/l, protein toàn phần là 43,32 g/l, creatinine là 82,25 µmol/l, cholesterol toàn phần là 8,81 mmol/l, TG là 2,35 mmol/l, HDL-c là 1,74 mmol/l, LDL-c là 6,31 mmol/l, IgA là 220,47 mg/dl, IgM là 142,22 mg/dl. Trong khi nhóm bệnh nhân HCTH do viêm cầu thận khác có các chỉ số là 394/751 bệnh nhân có tuổi từ 40 trở lên, 457/751 là nam, 363 BN có tăng huyết áp, BMI trung bình là 25,45, nồng độ albumin trung bình là 33,94 g/l, protein toàn phần là 58,33 g/l, creatinine là 104,31 µmol/l, cholesterol toàn phần là 5,72 mmol/l, TG là 2,22 mmol/l, HDL-c là 1,26 mmol/l, LDL-c là 3,81 mmol/l, IgA là 259,46 mg/dl, IgM là 111,43 mg/dl. Khi so sánh nhận thấy nhóm HCTH do viêm cầu thận có tỷ lệ THA, nồng độ protein toàn phần, albumin, creatinine máu và IgA cao hơn, tuy nhiên nồng độ cholesterol toàn phần, HDL và LDL thấp hơn nhóm bệnh nhân HCTH do thay đổi tối thiểu có ý nghĩa, p< 0,01.

Năm 2018, Dumas De La Roque C. và cộng sự [82] đã nghiên cứu trên các bệnh nhân HCTH do bệnh cầu thận xơ cứng ổ đoạn và do bệnh cầu thận thay đổi tối thiểu với số lượng bệnh nhân là 68 và 97 để tìm các yếu tố tiên lượng bệnh. Nhóm HCTH thay đổi tối thiểu có tuổi trung bình là 47 tuổi, trong đó 34% bệnh nhân tuổi từ 60 trở lên, 26,8% bệnh nhân tuổi < 30, tỷ lệ nam/nữ 55/42, chỉ số BMI là 27, tỷ lệ BN THA chiếm 48,8% trong đó: 35,5% bệnh nhân từ 60 tuổi trở lên, 21,7% bệnh nhân < 30 tuổi THA và 53,3% BN THA ở tuổi 30 -59, MLCT trung bình là 79 ml/phút, phân bố theo BTMT như sau: giai đoạn 1: 36,8%, giai đoạn 2: 28,7%, giai đoạn 3: 26,5%, giai đoạn 4: 3,4%