Chương III: Các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm
3.3.1. Xác định S.aureus đề kháng methicillin (chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR)
PCR)
3.3.1.1. Vật liệu
Các chủng vi khuẩn S. aureus ATCC 25923 (MSSA), chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA) và một số chủng khác.
Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu này tham khảo theo Mehrotra và do Sigma Aldrich cung cấp. Bộ kit PCR và một số hóa chất sinh học phân tử khác.
Tên Trình tự Gen vị trí Nucleotic Kích thướca (pp) FEMA-1 AAAAAAGCACAT AACAAGCG femA 1444-1463 132 FEMA-2 GATAAAGAAGAA ACCAGCAG femA 1575-1556 132 MECA-1 ACTGCTATCCAC CCTCAAAC mecA 1182-1201 163 MECA-2 CTGGTGAAGTT GTAATCTGG mecA 1344-1325 163 3.3.1.2. Phương pháp
Chuẩn bị DNA vi khuẩn được thực hiện theo Feriera. Đun cách thủy ở nhiệt độ sôi huyên phù vi khuẩn (5 khóm/500µl TE 1X) trong 10 phút. Ly tâm 14000 vòng trong 5 phút. Bỏ cặn, thu phần dịch nổi. Pha lỗng 10 lần bằng TE 1X.
Multiplex PCR dùng 2µl DNA chiết nhanh trực tiếp huyền phù vi khuẩn mô tả ở trên, thêm vào 48µl hỗn hợp PCR 1X (16mM (NH4)2SO4, 67mM Tris HCl (pH 8,8)), 0,2mM cho mỗi thứ trong 4 loại dNTP, 1,5mM đến 2,5mM MgCl2, 5pM đến 20pM của mỗi femA, 25 pM của mỗi mecA và 1,25 U của Taq DNA polymerase.
Chu kỳ luân nhiệt là 950C trong 10 phút, các bước (940C trong 30 giây, 50- 650C trong 30 giây, 720C trong 1 phút) lặp lại 35 lần, 720C trong 10 phút (iCycler, BioRad). Sau khi xác định điều kiện tối ưu của multilex PCR, một phản ứng được tiến hành với mồi femA để nhận định các chủng S. aureus, với mồi mecA để phát hiện dấu hiệu đề kháng, với cả hai mồi cho mỗi chủng vi khuẩn.
Sau khi khuếch đại bằng PCR, lấy 5µl sản phẩm phân tích điện di gel agarose 2% để ước tính kích thước của sản phẩm bằng cách so sánh với thang chuẩn 100bp. Gel được nhuộn với ethidium bromide và quan sát dưới tia UV (GelDoc, BioRad).
Xây dựng chứng nội tại dùng chung mồi của mecA nhưng cho sản phẩm khuếch đại có chiều dài lớn hơn (khoảng 240bp) để kiểm soát sự ức chế phản ứng PCR với mỗi mecA. Tiến hành qua các bước:
- PCR khuếch đại mecA, tinh chế và cắt với enzyme cắt giới hạn thích hợp. - Cắt đoạn DNA tổng hợp hóa học, có mang trình tự ở 2 đầu nhận biết
- Lai và biến nạp vào E.coli. Chọn lọc dòng tái tồ hợp, nuôi và chiết plasmid dùng làm DNA chứng nội tại.
- Khảo sát độ pha lỗng thích hợp của chứng nội tại để cho vào PCR mix. Thiết kế bộ thử nghiệm gồm các thành phần:
- Lọ dung dịch lưu mẫu chứa môi trường tăng sinh chọn lọc cho MRSA. - Que bông để quẹt mũi.
- Ống dung dịch đệm ly trích mẫu: chứa các chất phá màng tế bào vi khuẩn (Triton-X-100, Tween 20, Tris HCl pH 8, EDTA).
- Tube chứa hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR, dung dịch đệm PCR, MgCl2, dNTP, các mồi Taq DNA polymerase.
- Ống chứa chứng nội tại.