Chương III: Các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm
3.3.1.3.Kết quả và thảo luận
Gen mecA dùng để xác định các chủng MRSA và gen femA đặc trưng cho
S.aureus và không phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Tham khảo các nghiên cứu
trước đây, nồng độ 25pM mỗi mecA trong một phản ứng được chọn cố định và khảo sát tìm nồng độ tối ưu cho mỗi femA.
Ở các nồng độ của femA 5pM và 10pM (hình 3.3), chỉ cho một băng tương ứng mecA tại các giếng khuôn MRSA, trong khi MRSA không cho băng. Ở nồng độ 15pM của femA, MRSA trong giếng 12 cho một băng mecA nhưng trong giếng 13 và 14 đã cho hai băng femA và mecA. Giếng 15 khơng xuất hiện băng nào (hình 3.3).
Ở nồng độ 20pM của femA, các khn MRSA (các giếng 16-19, hình 3.3) cho 2 băng femA và mecA, khuôn MRSA chỉ cho băng femA đặc trưng của S.aureus (giếng 20, hình 3.3).
Chọn các nồng độ của các cặp mồi mecA và femA trong M-PCR lần lượt là 25pM và 20pM cho các thử nghiệm tiếp theo.
Hình 3.3: Gel agarose phân tích M-PCR với cặp mồi femA ở các nồng độ khác nhau Nồng độ cặp mồi mecA giữ cố định 25pM và lần lượt bốn mức nồng độ femA: 5pM (giếng 1-5), 10pM (giếng 6-10), 15pM (giếng 11-15) và 20pM (giếng 16-20) trên DNA các chủng vi khuẩn, thang chuẩn DNA là 100bp.
Chửng S. aureus ATCC 25923 (MSSA) là giếng 5, 10, 15 và 20. Chủng S.
aureus ATCC 43300 (MRSA) là giếng 1, 6, 11 và 16. Các giếng còn lại là của các
chủng khác.
Thực hiện khảo sát năm mức độ MgCl2 và tám mức nhiệt độ lai (hình 3.4) cho thấy mức 1,75mM MgCl2 và nhiệt độ lai 55,70C cho hai băng rõ và đẹp (hình 3.4B, giếng 5).
Để loại trừ sự hiện diện của các chất ức chế phản ứng PCR trong mẫu chứng nội tại dùng mỗi mecA được thiết kế và đưa vào hỗn hợp phản ứng.
Hình 3.4: Gel agarose phân tích M-PCR gradient nồng độ MgCl2 và nhiệt độ lai trên chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA)
Nồng độ MgCl2 lần lượt là 1,5mM (A), 1,75mM (B), 2mM (C), 2,25mM (D) và 2,5mM (E). Nhiệt độ là 500C, 50,10C, 530C, 55,70C, 59,50C, 62,30C, 640C và 650C tương ứng với các giếng từ 1-8.
Kết quả xác định độ pha lỗng tối đa của chứng nội tại được trình bày trong hình 3.5, nồng độ pha lỗng nhất có cho băng chứng nội tại là 10-6 (hình 3.5A, giếng 5), cịn trong multiplex PCR, ba băng 132bp (femA), 163bp (mecA) và 243bp (chứng nội tại) xuất hiện đủ ở 3 độ pha lỗng của chứng nội tại (hình 3.5B), chỉ có băng số 6 hiển thị rõ ràng nhất. do đó, nồng độ pha lỗng 10-6 được chọn để cho vào multiplex PCR.
Hình 3.5: PCR kiểm tra độ pha lỗng chứng nội tại
Hình A là độ pha lỗng chứng nội tại lần lượt từ giếng 1-9 là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 và 10-10. Hình B là độ pha lỗng của chứng nội tại trong multiplex PCR trên khuôn MRSA lần lượt từ các giếng 2 đến giếng 10 là từ 10-2-10- 10, giếng 1 khơng cho chứng nội tại.
Hình 3.6: Bộ kít M-PCR phát hiện MRSA