III.1. Khái niệm:
Kỹ thuật gen thực vật là sự chuyển 1 đoạn ADN lạ, thờng là 1 gen có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất định vào tế bào thực vật nh: Khả năng kháng sâu hại, kháng virut hay kháng thuốc diệt cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gen lạ đợc lồng vào genome (hệ gen), biểu hiện ra kiểu hình và di truyền ổn định đợc gọi là cây chuyển gen. Gen lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật, động vật, thậm chí gen tổng hợp.
Quá trình chuyển gen bao gồm nhiều bớc: xác định và phân lập gen có ích, nhân gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu hiện của gen.
Trong các bớc trên, kỹ thuật chuyển gen đóng vai trò quyết định đối với kết quả chuyển gen.
III.2. Các hình thức chuyển gen vào tế bào thực vật và các bớc cơ bản của mỗi hình thức.
Chuyển gen vào tế vào thực vật có thể thực hiện gián tiếp thông qua vector hoặc trực tiếp.
III.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua vector:
* Vector là AND kép mạch vòng đợc thiết kế gồm có 5 điểm chính:
- Có vị trí cắt của enzym cắt giới hạn. Mỗi loại enzym cắt giới hạn chỉ cắt ở 1 điểm. - Có khả năng tự nhân đôi độc lập với hệ gen tế bào chủ.
- Có khả năng xâm nhập đợc vào tế bào chủ và tồn tại trong 1 thời gian.
- Có các gen chỉ thị để nhận biết tế bào mang vector. Thờng là gen kháng sinh , thuốc diệt cỏ...
- Có yếu tố để gen đợc biểu hiện thành kiểu hình.
Vector sử dụng cho tế bào thực vật đợc thiết kế từ plasmid của agrobacterium tumefacien kết hợp với plasmid của E.coli.
* Các bớc:
- Phân lập gen có ích từ thể cho (hoặc tổng hợp nhân tạo) và nhân gen.
- Cắt và nối gen của tế bào cho vào vector ở những điểm xác định nhờ enzym cắt giới hạn ( restriction enzym) và enzym nối lygase đặc hiệu tạo ADN tái tổ hợp.
- Đa ADN tái tổ hợp vào tế bào E.coli để nó nhân bản.
-Tế bào E.coli có ADN tái tổ hợp tiếp hợp với agrobacterium tumefacien tạo vi khuẩn A.tumefacien mang ADN tái tổ hợp.
-Nhiễm A.tumefacien vào tế bào thực vật cần chuyển gen, gen cần chuyển nằm trong ADN tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn sẽ đợc chuyển vào hệ gen thực vật
- Tái sinh tế bào đợc chuyển gen - Chọn cây biểu hiện gen đợc chuyển. Theo sơ đồ:
Vetor ADN thể cho
Enzym cắt giới hạn Enzim cắt giới hạn
Lygase (enzym nối)
ADN tái tổ hợp
Biến nạp
TB E.coli
III.2.2. Chuyển gen trực tiếp:
Sử dụng vetor chỉ thích hợp cho một số loại cây trồng. Đặc biệt cây ngũ cốc, nhiều loại đậu đỗ ít hoặc không phù hợp với chuyển nạp thông qua vector. Nhiều cố gắng đã đợc tiến hành để phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào tế bào không thông qua vetor. Đó là:
* Chuyển gen nhờ xung điện:
Chuyển gen nhờ xung điện là áp dụng xung điện có hiệu điện thế cao lên tế bào trần để tạo ra khe hở nhất thời ở màng tế bào làm cho các đại phân tử nh ADN có thể xâm nhập vào tế bào. Thời gian và cờng độ xung điện đợc điều chỉnh sao cho tế bào sống sót và hấp thụ đợc ADN.
* Phơng pháp bắn hạt:
Hạt vàng hay won - fram, đờng kính 1-4Mm bọc ADN, đợc kết tủa với Cacl2, Spermidine hoặc Polyetylen glycol. Hạt bọc ADN đợc tăng tốc (300 -600m/s) bằng 1 thiết bị đặc biệt là máy bắn hạt. Với tốc độ này hạt xâm nhập qua thành vào màng tế bào. Mật độ hạt sử dụng phải đợc điều chỉnh sao cho không tổn thơng tế bào.
* Phơng pháp vi tiêm: dùng micropipep hay xi lanh nhỏ để đa trực tiếp ADN vào tế bào trần.
Những giống cây trồng mới tạo ra bằng công nghệ gen thờng đợc gọi tắt là cơ thể sống bị biến đổi di truyền (GMO – Genetically Modified Organism).
Tính đến năm 1999 đã có hơn 2000 dòng cây chuyển gen khác nhau đã đợc tạo ra ở Mỹ, 250 dòng cây chuyển gen đợc tạo ra ở châu Âu, trong đó có 1030 giống/dòng ngô, 325 giống/dòng cà chua, 279 giống/dòng đậu tơng, 265 giống/dòng khoai tây và 193 giống/dòng cây kháng thuốc diệt cỏ, 252 dòng kháng vius, 676 dòng kháng côn trùng, 106 dòng kháng bệnh, 738 dòng mang tính trạng chất lợng và 199 dòng mang các tính trạng khác. Tính đến năm 1999 Trung Quốc đã trồng đợc 2,0 triệu hecta các giống bông chuyển gen Bt tổng hợp độc tố tiêu diệt sâu, dệp với 8 giống bông đã đợc thơng mại hoá ( Transgense Nutzpflanzen, 1999).
Trên thế giới các giống cây chuyển gen đợc trồng trên diện tích 44,2 triệu ha vào năm 2000 và 52,6 triệu ha vào năm 2001, chiếm 19% tổng diện tích các cây trồng chính nh đậu tơng, bông, cải dầu, ngô. Các giống bông GMO chiếm 45% tổng diện tích trồng bông ở Mỹ. Các giống ngô GMO chiếm 25%, các giống đậu tơng chiếm 38%. các nớc có diện tích trồng cây chuyển gien (GMO) lớn nhất là Mỹ (35,76 triệu ha), Argentina (11,8 triệu ha) và Canada (3,2 triệu ha). Diện tích trồng các cây chuyển gen tiếp tục tăng trong thời gian tới. Trung Quốc là nớc có tiềm lực kỹ thuật mạnh và phát triển nhanh trong lĩnh vực sản xuất các cây trồng chuyển gen. Nớc này chiếm 7% diện tích toàn cầu nhng chiếm tới 20% dân số thế giới. Tính đến năm 1999 Trung Quốc đã có 12 giống cây trồng đợc thơng mại hoá, trong đó có 8 giống bông chuyển gen, xếp thứ 4 thế gíơi về diện tích cây chuyển gen, (bông, cà chua, thuốc lá, khoai tây) và có ít nhất 20 giống cây trồng GMO đang đợc phát triển ( ngô, khoai tây, lúa, thuốc lá, lạc, sắn).
Các nớc trồng cây chuyển gen chính là Mỹ, Argentina, Canada và Trung Quốc. Các nớc Châu Phi nh Ai Cập, Zimbabue, Kenya đang bắt đầu khảo nghiệm trên đồng ruộng các giống khoai lang kháng virus, bông Bt, khoai tây và các cây rau chuyển gen. Diện tích trồng thử nghiệm các giống cây chuyển gen chiếm 2% ở các nớc Châu á: Indonesia, Thái Lan, Philippines và chủ yếu là Trung Quốc. Các nớc công nghiệp phát triển chiếm 91% diện tích cây chuyển gen.
Nhờ những phát hiện mới của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, các kỹ thuật chuyển gen ngày càng hiệu quả hơn với các gen có giá trị kinh tế cao hơn, các giống cây trồng chuyển gen chắc chắn sẽ đợc áp dụng trên quy mô lớn hơn trên các đối tợng cây trồng ngày càng đa dạng.
Các tính trạng chủ yếu đợc cải tiến bằng con đờng chuyển gen.
a. Tạo giống kháng sâu hại:
– Gen tạo ra độc tố có tác dụng diệt sâu, ví dụ nội độc tố Bt từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
- Gen tạo ra chất ức chế enzym phân giải protin làm hạn chế khả năng tiêu hoá thức ăn của sâu hại (chất ức chế tripsin)
Phòng trừ sâu hại bằng hoá học không những tốn kém mà còn gây hậu quả xấu tới môi trờng. Do đó tạo ra các giống kháng sâu hại thông qua kỹ nghệ di truyền dựa vào gen độc tố BT của vi khuẩn Bacillus thuringiensis là một tiến bộ quan trọng trong chọn giống kháng sâu. Độc tố BT là những tinh thể tạo ra trong quá trình tạo bào tử của vi khuẩn. Những Protein tinh thể này có hoạt tính kháng một số loại côn trùng nhng không độc với ngời. Khi sâu hấp thụ tinh thể protein, độ PH cao trong ruột giữa phân giải tinh thể và giải phóng protein. Vào giai đoạn này protein cha có hoạt tính độc, nhng các enzim proteaza đặc biệt trong dịch ruột phân huỷ protein chỉ còn lại bộ lõi kháng enzim proteaza, bộ lõi này hoàn toàn có hoạt tính. Bộ lõi này liên kết với chất nhận đặc thù ở tế bào biểu mô nằm dọc theo ruột giữa và tự lồng vào màng nguyên sinh của tế bào. Tích tụ các protein làm cho tế bào bị rò rỉ chất dinh dỡng và chết. Côn trùng ngừng ăn và chết đói trong vòng 24 tiếng đồng hồ.
Độc tố BT có hoạt tính với nhiều loài sâu hại, đặc biệt sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera. BT gen đã đợc chuyển vào cây để phòng trừ sâu hại nh phòng Manduca sexta
hại thuốc lá, sâu xanh hại cà chua và sâu xanh đục quả bông Helicoverpa zea, Một số cây…
trồng chuyển gen BT đợc trồng trên quy mô thơng mại là cà chua, bông, ngô, khoai tây ( James và Krattiger, 1996; James, 1997).
Một protein nữa có khả năng diệt sâu là chất ức chế proteaza tách chiết từ một cây nhiệt đới, cây khoai môn khổng lồ. Cây này tạo ra một lợng chất ức chế cao trong củ. Chất ức chế tinh khiết có tác dụng làm giảm khả năng sinh trởng của sâu non Heliothis arigera, do làm mất hoạt tính của enzim proteaza tiêu hoá nên chúng bị chết đói. Tơng tự, gen mã hoá chất ức chế tripsin của đậu bò cũng đợc chuyển vào thuốc lá để phòng trừ sâu hại lá.
b. Tạo giống kháng virus.
- Cản trở sự truyền virut
- Cản trở sự nhân lên của virut trong tế bào. - Chống lại sự biểu hiện của bệnh ( triệu chứng)
- Kỹ nghệ di truyền là một kỹ thuật có hiệu quả để tạo ra giống cây trồng kháng virut. Các gen sử dụng để chuyển vào cây đều đợc phân lập từ virut. Phơng pháp phổ biến nhất là chuyển gen mã hoá vỏ protein của virut vào cây – một cơ chế đợc gọi là bảo vệ chéo. Tế bào thực vật biểu hiện gen mã hoá vỏ protein cản trở quá trình nhân của virut. Bằng phơng pháp này ngời ta đã tạo giống kháng đợc 36 loại virut đại diện cho 16 nhóm khác nhau (Lakin, 1995), trong đó có những bệnh có ý nghĩa kinh tế nh khảm hoa lá cỏ medi, hoa lá da chuột, virut xoăn lá khoai tây, virut đốm vòng đu đủ…
Chiến lợc tạo giống kháng virut thứ hai sử dụng gen mã hoá replicaza của virut. Enzim replicaza là một enzim giúp cho virut tổng hợp axit nucleic trong tế bào thực vật. Cây đợc chuyển gen chứa một đầu nhất định của gen replicaza. Do đó phân tử ARN này cạnh tranh với ARN của virut trong quá trình liên kết với enzim replicaza, Nếu tế bào thực vật sao mã đủ loại ARN này thì có khả năng ức chế quá trình nhân của virut.
Khả năng thứ ba là sử dụng các gen có trình tự ngợc chiều (anti – sense) với các gen nhất định của virut. Gen có trình tự ngợc sao mã mARN có tình tự bổ sung với ARN của virut. ARN ngợc chiều can thiệp trực tiếp vào sự biểu hiện gen của virut bằng cách kết hợp với ARN của virut tạo thành phân tử kép, ngăn cản quá trình dịch mã hay sự vận chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất.
Những cây trồng chuyển gen kháng virut trồng trên diện tích lớn gồm thuốc lá, cà chua, bí đỏ và đu đủ ( James và Krattiger, 1996:James, 1997).
c. Tạo giống kháng thuốc trừ cỏ:
– Sản xuất d thừa loại protein (enzym) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ, bảo đảm đủ lợng cần thiết cho các chức năng của tế bào khi có mặt của thuốc.
– Giảm khả năng liên kết của protein mẫn cảm với thuốc bằng cách thay đổi cấu trúc của Protein.
- Trang bị cho cây khả năng làm mất hoạt tính chuyển hoá của thuốc trừ cỏ.
Sản xuất d thừa protein(enzim) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ đã đợc áp dụng thành công đối với nhiều loài cây trồng để tăng tính kháng thuốc trừ cỏ, ví dụ Phosphinotricin (th ơng phẩm là Basta) và bialaphos. Phosphinotricin ức chế enzym tổng hợp glutamin (glutamin synthaza – GS). ức chế GS gây ra sự tích luỹ amonia nhanh chóng trong cây làm cho cây chết. Tăng sự tổng hợp GS trong cây lên nhiều lần có thể khắc phục đợc ảnh hởng của thuốc trừ cỏ. De Block (1987) đề xuất một chiến lợc liên quan tới một enzym có khả năng khử độc của thuốc trừ cỏ Basta. Gen Bar phân lập từ Steptomyces hyrgyscopicus tham gia vào quá trình sinh tổng hợp bialaphos và mã hoá enzym phosphinotricin exetytranferaza (PAT), enzym này axetyl hoá nhóm NH2 tự do của phosphinotricin và làm cho cây không bị ngộ độc.
Đột biến của gen protein mục tiêu làm mất khả năng liên kết của thuốc trừ cỏ cũng tăng khả năng kháng hay chịu thuốc trừ cỏ, chẳng hạn nh thuốc trừ cỏ glyphosate, atrazine và sulphonylurea.
Một số cây trồng đợc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và trồng trên quy mô thơng mại là đậu tơng, ngô, bông, cải dầu, thuốc lá (James và Krattiger, 1996:James, 1997).
d. Tăng chất lợng sản phẩm:
Cây thực phẩm chuyển gen đợc đa vào sản xuất năm 1994 ở Mỹ là giống cà chua “Flavi Savrr” ở các giống cà chua thông thờng, một số enzim đợc tạo ra trong quá trình chín, trong đó có poly-galacturonaza, phân giải thành tế bào làm mềm quả cà chua.Những giống cà chua nh vậy phải thu hoạch khi quả cha chín để vận chuyển và xử lý để quả chín trớc khi tiêu thụ.
Để làm chậm quá trình chín của quả, ngời ta đã phân lập gen mã hoá enzim poly- galacturonaza và chuyển vào bộ gen của cà chua. Tuy nhiên gen chuyển vào ngợc chiều với gen bình thờng (anti-sense), do đó làm mất chức năng của gen bình thờng trong việc tổng hợp poly-galacturonaza. Giống cà chua nh vậy đã đợc sản xuất thơng mại ở Mỹ ( giống Flavr Savr) ( James và Krattiger, 1996).