III. 1. Đối với cây sinh sản bằng hạt:
1. Chuẩn bị vật liệu:
Về nguyên tắc, vật liệu đợc chọn lên là những giống tốt nhất, thích nghi với điều kiện địa phơng và có ít nhất các tính trạng cần đợc cải tiến. Thứ càng tốt bao nhiêu thì ở chúng tích luỹ càng nhiều gen trội bấy nhiêu và càng có khả năng cho nhiều dạng ĐB có giá trị.
Cũng có thể dùng các dạng con lai F1, vì nó gồm 2 genome khác nhau, khi đồng thời chịu tác động của mutagen thì khả năng tái tổ hợp gen sẽ tăng lên và phổ ĐB sẽ rộng hơn. Đối với hạt lai F1 phải dùng nồng độ mutagen thấp thua khoảng 2 lần so với mức bình thờng.
Đối với cây sinh sản bằng hạt thì việc dùng các mutagen vật lí hay hoá học đều tiện lợi và thích hợp. Tuy nhiên hạt là một tổ chức đa bào, mà ĐB thì chỉ xảy ra ở một hay một số tế bào, nên thờng có hiện tợng khảm xảy ra ở cây F1.
- Một ĐB gen thực nghiệm thực sự thờng ở trạng thái dị hợp tử và không tác động đến chức năng sở cấp của tế bào, nh sự tái bản của ADN và sự sinh trởng của tế bào.
Còn những ĐB lớn về NST sẽ tác động đến sự cạnh tranh tế bào và gây ra sự “chọn lọc l ỡng bội’’. Một ĐB muốn đợc duy trì qua các thế hệ, nó phải có sức cạnh tranh lớn và phải có khả năng sản sinh ra các giao tử. Các ĐB có thể bị mất đi ở pha đơn bội (chẳng hạn do sự cạnh tranh ống phấn) hoặc ở thế hệ M2, mà ở thế hệ này bắt đầu bằng sự phát triển hợp tử hoặc phôi chứa các ĐB ở trạng thái đồng hợp tử.
- Xử lí ĐB đối với giao tử hoặc hợp tử vào trớc lúc phân chia lần thứ nhất của hợp tử dẫn đến việc xuất hiện những cây ĐB.
- Các dạng vật liệu ban đầu nên phong phú để có khả năng làm tăng tính đa dạng của biến dị xuất hiện ở M2.
2. Chọn mutagen và vật liệu:
Tần số ĐB và phổ ĐB phụ thuộc vào loại mutagen, liều lợng, đối tợng.
- Tia X,γ đợc sử dụng rất rộng rãi (vì chúng có khả năng xuyên thấu và việc tính liều lợng
chính xác).
- Tia UV có khả năng xuyên thấu thấp nên chỉ thích hợp cho hạt phấn hoặc mô nuôi cấy invitro.
-- Neutron nóng hoặc neutron nhanh (mức năng lợng 0,022v và dới 10Meis) thờng gây ra các ĐB NST.
- Các mutagen hoá học thờng đợc coi là các tác nhân có khả năng gây ra các ĐB gen với tần số cao, nhng có đặc điểm là tính thẩm thấu không đợc xá định chính xác cho từng loại đối t- ợng, tính không ổn định sự biến chất và cuối cùng là tính không an toàn.
Tuỳ theo từng đói tợng mà nồng độ, liều lợng mutagen khác nhau. Thể hiện ở bảng sau:
Cây trồng Vật liệu Mutagen Liều lợng/ nồng độ
Lạc Hạt tiêu Đậu tơng Đậu Hà lan Cà chua Lúa Hạt khô Hạt khô Hạt khô Hạt khô Hạt phấn Hạt khô tia gamma tia gamma tia gamma DES EMS tia X 20-30krad 14-22 krad 10-20 krad 0,2%, 15h,200C 0,8%, 24h,240C 14-28 krad
Ngô Khoai tây Hoa cẩm chớng Cam Nho Chuối Mía Khoai lang Hạt khô Củ thân callus chồi ngủ đỉnh chồi (invitro) chồi thân tia gamma EMS tia X tia gamma
tia X hay tia gamma tia gamma tia gamma tia gamma 14-28 krad 100-500ppm 1,5-2 krad 8-16 krad 2,5-3,5 krad 1-2,5 krad 3,7-7 krad 20 krad 3. Theo dõi và chọn lọc ĐB: a) Nghiên cứu thế hệ M1: Hạt xử lí M1.
+ ở thế hệ M1 phải gieo 700-1500 hạt để đảm bảo cho việc thu đợc từ 250-500 cây ra hoa, kết hạt đối với mỗi liều lợng hay nồng độ và sẽ tạo ra 250-500 họ ở M2.
Hạt sau khi xử lí bằng các tác nhân vật lí hoá học sẽ có một số biểu hiện khác nhau: - Có thể không nảy mầm đợc.
- Nảy mầm đợc nhng quá trình sinh trởng bị ức chế.
- Một số sống đợc thì có quá trình giảm phân bị rối loạn mà về sau đa đến hiện tợng bất thụ.
-Tất cả những hiện tợng này có liên quan đến cơ chế tác dụng và liều lợng của mutagen →
Muốn tính tỉ lệ sống sót để xác định tính mẫn cảm của cây đối với mỗi loại mutagen chỉ nên làm sau khi chồi mầm đã xuất hiện đợc một thời gian (thờng sau 2 tuần). Mức độ về hiệu quả huỷ hoại do mutagen gây ra ở M1đợc tính theo chỉ tiêu sau đây:
- Số lợng NST đợc sắp xếp lại trong kỳ giữa và kỳ sau của nguyên phân. - Sự giảm sức nảy chồi ở đồng ruộng.
- Sự kìm hãm sinh trởng ở giai đoạn đầu (trớc pha đẻ nhánh hay phân cành) - Tỉ lệ tơng quan giữa mầm bình thờng và mầm có thay đổi về hình thái.
Những phân tích tế bào cho thấy phạm vi bị huỷ hoại của NST tơng ứng với mức độ bị kìm hãm của sự sinh trởng. Do vậy mức độ kìm hãm của quá trình sinh trởng ở giai đoạn đầu là một trong những chỉ tiêu quan trọng về hiệu quả của mutagen (vì sẽ xác định đợc phạm vi bị huỷ hoại của NST)
+ ở thế hệ M1 thờng gặp hiện tợng khảm (vì sử lí hạt bằng mutagen). Khi cây sinh trởng, các tế bào mang ĐB này cũng phân chia và sinh sản, giữa các tế bầoếnỳ và các tế bào bình thờng xảy ra sự cạnh tranh.
- Nếu các tế bào bình thờng có u thế cao thì cuối cùng các tế bào mang ĐB sẽ mất đi hoặc chỉ hình thành nên một số mô nhất định.
Trờng hợp đầu cây sẽ trở lại bình thờng, trờng hợp sau cây sẽ có một số mô hoặc cành mang ĐB- những cây này gọi là cây khảm.
- Nếu các tế bào ĐB chiếm u thế cao thì nó sẽ lấn át các tế bào bình thờng và cuối cùng từ những tế bào ĐB này sẽ sản sinh ra một cơ thể mang ĐB toàn bộ.
Nếu là ĐB trội nó sẽ biểu hiện ở M1 và phát hiện dễ dàng.
Nếu là ĐB lặn nó giống với kiểu hình ban đầu nên khó phát hiện (trờng hợp này lại thờng xảy ra).
⇒Việc chọn lọc các cây có biến dị ở M1 là rất khó khăn. Các thí nghiệm cần lặp lại 2-3 lần, nếu mục đích chỉ là thu ĐB thì không cần lặp lại.
Tóm lại: Nghiên cứu thế hệ M1 xác định:
+ Tỉ lệ sống sót để xác định tính mẫn cảm của cây đối với mutagen.
gieo trồng
+ Mức độ bị kìm hãm của quá trình sinh trởng để xác định mức độ huỷ hoại của NST. + Nếu có xuất hiện ĐB trội biểu hiện ra hiểu hình và chọn lọc đợc .
+ Không xác định đợc phải gieo tất cả các hạt trong các họ của M1 để đợc M2.
2. Nghiên cứu thế hệ M2:
* Mục đích:
+ Chọn lọc ĐB có những tính trạng kinh tế tốt.
+ CL những cây phát triển tốt hoặc bình thờng để từ đó tách ra những ĐB nhỏ trong các thế hệ tiếp theo.
+ CL các cây có KH đột biến từ công thức (I) để tách các ĐB lặn đồng hợp ở M3. Vấn đề đặt ra là, từ M1 chọn những cây nh thế nào và bao nhiêu hạt để gieo ở M2.
Về nguyên tắc phải lấy tất cả các cây ở M1 để gieo ở M2, không phân biệt cây có biến dị hay không, những cây có biến dị nên gieo riêng.
Tuy nhiên, làm nh vậy khối lợng công việc ở M2 sẽ tăng lên rất nhiều, nhng đến nay vẫn cha có kết quả nào về việc chọn M1 nh thế nào để M2 cho nhiều ĐB nhất.
Việc chọn M1 phụ thuộc vào phơng pháp gieo chúng ở M2.
+ Nếu ở M2 ta thu theo họ thì ở M1 phải thu riêng từng cây, hạt mỗi cây ở M1 sẽ là một họ ở M2.
+ Nếu gieo hỗn hợp ở M1, thì hạt ở M2 gieo chung theo từng công thức (nồng độ, liều l- ợng). Từ lợng hạt chung ấy lấy ra một khối lợng hạt nhất định phù hợp với số cây cần thiết nghiên cứu ở M2. (Số hạt đợc chọn ở M1 để cho ra M2 phải lớn hơn số hạt đã gieo để cho M1). Từ M1→ M2 phải cách li thật tốt, tránh tạp giao.
Điều quan trọng đối với tất cả các thế hệ là cần kiểm tra độ xác thực của các dạng đột biến. Các bớc cụ thể nh sau:
- Thế hệ M1: đem gieo hạt hay bộ phận đã xử lý để tạo thành quần thể M1. Trong thời kỳ sinh trởng, chủ yếu kiểm tra đánh giá những thay đổi về mặt hình thái, ở thế hệ này có thể phát hiện đột biến nếu là đột biến trội. Thu hoạch riêng từng cây để gieo vụ sau.
- M2: Hạt của từng cây đột biến gieo riêng. Những cây còn lại có thể gieo riêng hoặc gieo hỗn hợp. Theo dõi kỹ trong thời kỳ sinh trởng để phát hiện những biến dị có lợi, đồng thời kiểm tra tính di truyền của thể đột biến trội thấy ở M1.
Nếu là cây giao phấn, cây đột biến trội ở M1 phải thụ phấn cỡng bức.
- M3: gieo riêng hạt những cá thể chọn ra ở M2 thành từng dòng. Kiểm tra di truyền (phân ly) các đột biến nhận đợc ở M2 và tiếp tục tìm kiếm các dạng đột biến mới.
- M4 và các thế hệ tiếp theo:
Gieo riêng các dòng đột biến, so sánh, chọn lọc để phát hiện những dòng tốt.
Để tăng hiệu quả của phơng pháp này ngời ta có thể dùng kỹ thuật gây đột biến qua nhiều thế hệ và kết hợp giữa một số tác nhân khác nhau; kết hợp lai tạo với gây đột biến thực nghiệm.
III.3. Một số thành tựu và nguyên tắc phơng pháp chọn giống đột biến:
Lần đầu tiên một hội nghị do FAO ( Tổ chức Nông nghiệp và Lơng thực của Liên Hợp quốc) và IAEA (cơ quan Năng lợng nguyên tử thế giới) tổ chức vào năm 1964 ở Roma đã đa ra những đánh giá về kết quả và triển vọng của phơng pháp chọn giống đột biến đối với việc
cải tiến giống cây trồng. 5 năm sau, tại một hội nghị khác ngời ta công bố đã có 77 giống đột biến ra đời.
Tại hội nghị do FAO/IAEA tổ chức năm 1990, ngời ta thông báo đã có 1363 giống cây trồng đợc tạo ra bằng phơng pháp này ở 48 quốc gia - trong đó Việt Nam có 6 giống ngũ cốc và 3 giống cây trồng khác ( Micke, 1990, FAO/IAEA, 1991). Trong số 1363 giống mới đó có đến 599 giống hoà thảo và 415 giống cây cảnh. Gần đây nhất, cũng theo số liệu của FAO/IAEA thì đã có tới gần 1800 giống cây trồng đợc tạo ra bằng phơng pháp gây đột biến thực nghiệm (Maluszinski, 1996). Hơn 90% các giống đột biến này đợc gây tạo ra nhờ sử dụng tia X và gamma. Tuy nhiên, điều này không ám chỉ rằng, các mutagen hoá học là không có lợi, mà có lẽ nó chỉ cho thấy rằng, phần lớn các thí nghiệm đã đợc tiến hành với các tia X và tia gamma.
Phần lớn các giống đột biến đợc đa vào sản xuất là những dạng có thay đổi về kiểu hình ( cấu trúc cây), thời gian ra hoa, màu và dạng hoa, kích thớc và màu quả, chống sâu bệnh ( Donini,1984). Một số đột biến có giá trị khác nh, thay đổi hàm lợng protein, axit amin, chất lợng tinh bột ở nội nhũ hoà thảo ( lúa, lúa mì, ngô...) ở ngô, lúa, nhờ phơng pháp này ngời ta đã tạo ra đợc các dòng cận phối có khả năng tổ hợp tốt để cho ra các con lai có u thế lai; một số đột biến khác có tính bất thụ đực hoặc phục hồi tính hữu thụ rất cần cho việc sản xuất hạt lai FAO/IAEA, 1991. Một số dạng đột biến cho sản lợng cao hơn dạng ban đầu. Dới đây sẽ giới thiệu một số giống cụ thể nh vậy.
- Lúa mạch không đổ “ Pallas”; lúa mạch thấp cây, chín sớm “Mari” (Thụy Điển); lúa mạch “Vena” chống bệnh gỉ sắt (áo); lúa mạch “Penrad” chịu rét khoẻ (Mỹ); lúa mì “Iuta” sản lợng cao, chịu rét, rơm ngắn (Đức); lúa kiều mạch “ Pholorad” chống bệnh nấm đen, rơm ngắn, sản lợng cao; lúa kiều mạch “ Allamo” X chống bệnh giỏi (Mỹ).
- Lúa có năng suất cao ( ấn Độ, Nhật Bản); lúa chống sâu bệnh, chịu thâm canh (A20, DT10, Xuân số 5 - Việt Nam); lúa chịu chua mặn, chịu rét, cứng cây (DT11, Xuân số 6-Việt Nam); giống lúa Tài nguyên ĐB-100, giống lúa tám thơm ĐB không mẫn cảm với quang chu kỳ, thời gian sinh trởng ngắn, năng suất và chất lợng gạo cao (Việt Nam).
ở Trung Quốc, các giống lúa đột biến đợc trồng trên hàng trăm ha. ở Tiệp Khắc các giống lúa mạch đột biến làm bia đợc trồng rất phổ biến. ở California (Mỹ) khoảng 120.000ha đợc trồng bằng giống lúa đột biến với nhiều tính trạng tốt.
- Đậu Hà Lan “ Strol” năng suất cao ( Thuỵ Điển); đậu Hà Lan chín sớm, chống nấm, hàm lợng protein và lipit cao, màu sắc và kích thớc hạt thay đổi (Nga, Mỹ, Đức)
- Các giống đậu tơng “Sanilak”, “ Xiuei”, “Gretiot” chín sớm, chống nấm, chống bệnh đốm lá, không đổ (Mỹ); các giống đậu tơng chịu nóng M103 và DT84 (Việt Nam); đậu tơng chín sớm, chống nấm, hàm lợng protein, lipit cao ( Nga, Mỹ, Đức)
- Các cây lấy dầu khác: Mù tạc trắng “Primeke” (Thuỵ Điển); lạc “ NC4X” chống bệnh đốm lá (Mỹ); lạc củ to, hàm lợng dầu cao (Senegal); giống lạc V79 chịu hạn và giống D332 chống đổ, chịu rét khá (Việt Nam)
- Cà chua “Singa” sản lợng cao chín sớm quả giữ đợc hàng tháng trong phòng (Mỹ). Cà chua“Hồng Lan” quả tròn, không múi và chống bệnh mốc sơng(Việt Nam)
- Hoa cẩm chớng có thời gian nở hoa kéo dài (Mỹ)
- Giống bông đột biến No.108 có bụi dày, lá xanh đậm, chống đổ, chống bệnh giỏi, năng suất và chất lợng bông cao - nhờ việc xử lý tia γ từ nguồn Co60 với liều lợng 2000 rad (Nga)
Việc sử dụng các dạng phóng xạ trong chọn giống cây ăn quả cũng đã đem lại nhiều kết quả tốt. Ví dụ, ở mận ngời ta đã thu đợc những dạng chín sớm (Anh, Tây Đức); ở táo, lê có những dạng chịu rét khoẻ, màu sắc quả thay đổi (Tây Đức, Liên Xô, Thuỵ Điển, Anh, Đức); ở nho, bằng phơng pháp này đã khắc phục đợc hiện tợng không lai đợc giữa các loài.
ở các cây gỗ, dới tác dụng của phóng xạ đã xuất hiện những dạng có sự thay đổi về màu sắc, kích thớc, hình dạng, phân bố của lá, hoa, quả, tính hữu thụ, nhịp điệu sinh trởng và thời gian sinh trởng.
ở cây sinh sản, sinh dỡng, bằng phơng pháp này ngời ta đã cho ra đời nhiều giống đột biến có nhiều tính trạng quý nh: ra hoa sớm, không hạt ( anh đào, nho); thay đổi dạng quả, chín sớm (táo, nho, dâu đất); tính kháng sâu bệnh cao ( mía, táo, nho...). Rất nhiều cây cảnh đột biến đã đợctạo ra ở Hà Lan, ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Đức....có sự thay đổi về kích thớc và cấu trúc của cây, hoa, lá hoặc thay đổi về thời kỳ nở hoa hoặc yêu cầu về nhiệt độ.
ở Việt Nam, các nghiên cứu và ứng dụng của phơng pháp gây đột biến thực nghiệm vào chọn giống thực vật đã đợc bắt đầu khá sớm. Đó là vào năm 1966, tại Bộ môn Di truyền học, trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội, với các nghiên cứu trên cây lúa và cây đậu tơng ( Vũ Nguyên Hiền, Trịnh Bá Hữu, Phan Phải, Trần Minh Nam, Lê Duy Thành, Phạm Thành Hổ, Phạm Bá Phong, 1970; 1978; 1986; 1990...) . Sau đó, hớng nghiên này đã đợc triển khai tại nhiều cơ sở khác nh, Viện KHKTNN Việt Nam ( Trần Đình Long, Nguyễn Hữu Nghĩa), Viện cây LTTP ( Vũ Tuyên Hoàng, Nguyễn Tấn Hinh...), Viện di truyền nông nghiệp ( Phan Phải, Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Hoàng Tuyết Minh, Mai Quang Vinh...), Trờng ĐH S phạmI Hà Nội ( Nguyễn Minh Công, Lê Đình Trung...), Trờng ĐH Tổng hợp TP Hồ Chính Minh (Trần Minh Nam...), Trờng ĐH NN1 ( Lê Song Dự, Trần Tú Ngà, Đoàn Thị Thanh Nhàn...), Trờng ĐHNN2 (Võ Hùng...) . Nhờ vậy, cho đến nay, ở nớc ta đã có hàng chục giống mới đợc tạo ra bằng phơng pháp gây đột biến thực nghiệm ở một số cây trồng, nh lúa (A20, DT10, DT11, DT13, DT33, Xuân số 5, Xuân số 6, Tép hàng đột biến, Tám thơm đột biến), ngô (DT6, DT8...) , đậu tơng (M103, DT84, DT90, DT95, V48...), lạc (V79, 4329, DT332, DT329...), cà chua (“Hồng Lan”..., táo “ Má hồng”, “Đào tiên”, “ Đào muộn”, “ Đào vàng”, “H12”...)
Ngày nay IAEA và FAO là hai cơ quan phối hợp để tài trợ và theo dõi toàn bộ các nghiên