Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn vẹn của tế bào xoma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đờng nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên phải trên 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (Protolast) mới thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là nuôi cấy các tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật trên môi trờng dinh dỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Gồm các lĩnh vực:
I.1 Nhân giống invitro (ngoài cơ thể)
1. Mục đích:
Nhân nhanh cây trồng và sử dụng tuỳ mục đích, nh: làm vật liệu chọn giống, bảo quản tập đoàn giống,cung ứng giống,…
2. Một số phơng thức nhân giống invitro.
+ Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trởng để làm sạch virus cho cây trồng. Vì virus th- ờng không phân bố ở đỉnh sinh trởng.
Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh. áp dụng phổ biến ở dứa, mía, phong lan, khoai tây, ...
+ Tái sinh từ các bộ phận của cây nh: Đoạn thân, mảnh lá, cuống lá,... Qua các bớc:
- Mô thực vật tách rời đợc nuôi cấy trên môi trờng dinh dỡng loãng thích hợp để phát triển thành mô sẹo( chuyển tế bào tiềm năng bị hạn chế thành đa tiềm năng).
- Nghiền nát mô sẹo thành tế bào rời.
- Nuôi cấy các tế bào rời trên môi trờng đặc để phát triển thành cây hoàn chỉnh. - Chuyển ra vờn ơm để thích nghi dần với điều kiện tự nhiên.
- Phân phối sản phẩm. Theo sơ đồ
Môi trờng loãng Nghiền nát ………. Môi trờng
Mô sẹo ……… Cây hoàn chỉnh
Mô sinh dỡng TB rời đặc
Phân phối Vờn ơm
3. Thành tựu.
Đã thành công trên rất nhiều đối tợng.
Ví dụ: Nhân giống sạch vi rút từ đỉnh sinh tởng của khoai tây, mía, ...
Nhân nhanh giống, vật liệu từ các bộ phận khác nhau của hoa hồng, chuối, hoa cúc, phong lan, gừng, khoai tây, tre,...
I.2 Kỹ thuật đơn bội tạo giống mới và dòng thuần:
Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã đợc ngời ta biết đến từ lâu. Kể từ khi Blakeslee (1921) mô tả cây đơn bội đầu tiên ở Datura Stramonium, cây đơn bội tự nhiên đã đợc tìm thấy ở rất nhiều loại cây khác nhau. Tuy vậy các cây đơn bội tự nhiên xuất hiện một cách ngẫu nhiên với tần xuất rất thấp không thể đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu và chọn giống. Lần đầu tiên trên thế giới hai nhà khoa học ấn Độ (Guha và Maheshwari 1966, 1967) đã thành công trong việc tạo ra hàng loạt cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn invitro cây cà Datura innoxia. Ngay sau đó cây đơn bội đã đợc tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt các loại cây trồng khác. Mục đích tạo dòng thuần nhanh chóng và chọn lọc có hiệu quả.
Vật liệu ban đầu cho quá trình nuôi cấy in vitro để tạo cây đơn bội gồm: - Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa.
- Phôi non. Khi lai xa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H.Bulbosum với nhau, sau quá trình thụ phấn phôi đơn bội đã đợc hình thành do nhiễm sắc thể của H.bulbosum đã bị loại trừ, nhng nội nhũ của phôi đơn bội đã không phát triển. Sử dụng phơng pháp nuôi cấy phôi đã cứu đ- ợc các phôi này khỏi bị chết và tạo ra hàng loạt cây đơn bội (Jensen, 1977).
- Thụ tinh giả. Đây là quá trình thụ phấn nhng sau đó đã không xảy ra sự thụ tinh. Mặc dù vậy, tế bào trứng vẫn kích thích phát triển thành cây đơn bội.
- Noãn cha thụ tinh. Thành công của nuôi cấy noãn còn hạn chế ở một số cây trồng nh đại mạch, lúa mỳ, thuốc lá, củ cải đờng, ngô.
Trong số các vật liệu kể trên thì bao phấn, hạt phấn tách rời và noãn cha thụ tinh là những nguồn nguyên liệu quan trong và thờng đợc sử dụng hơn cả để tạo cây đơn bội.
Sau khi tạo cây đơn bội→đa bội hoá thành cây lỡng bội.
I. 3. Thụ tinh nhân tạo, nuôi cấy và tái sinh tế bào trứng, tế bào hợp tử, tế bào nội nhũ non thành cây trong điều kiện invitro:
Quy trình thụ tinh kép ở thực vật lần đầu tiên đã đợc thực hiện hoàn toàn trong điều kiên in vitro và sự phát triển của các sản phẩm sau thụ tinh đã đợc quan sát thờng xuyên dới kính hiển vi. Tế bào trứng tách rời sau khi thụ tinh đã tạo thành phôi và tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Tế bào trung tâm của túi phôi (2n nhiễm sắc thể) sau khi thụ tinh với nhân tế bào hạt phấn đã tái sinh invitro thành nội nhũ tam bội ở các cây hoà thảo nh lúa mì, lúa mạch, ngô và lúa nớc (Kranz và Kumlehn, 1999; Zhang et al, 1999)... những thành công này đang mở ra khả năng thao tác di truyền dới kính hiển vi nhằm tạo giống mới, trong đó có các giống tam bội ở cây trồng.
I.4. Công nghệ tế bào tạo giống cây ăn quả không hạt, chất lợng cao và cây lâm nghiệp u thế lai thông qua nuôi cấy nội nhũ tam bội. nghiệp u thế lai thông qua nuôi cấy nội nhũ tam bội.
Hiện tại có 3 phơng pháp công nghệ tế bào đang đợc áp dụng rộng rãi để tạo giống u thế lai không hạt và giống u thế lai tam bội không hạt.
a. Phơng pháp nuôi cấy và tái sinh cây từ nội nhũ tam bội đã đợc sử dụng khá phổ biến trong tạo giống cây ăn quả không hạt ở cam, quýt, bới, chuối, táo tây... và tạo giống cây rừng u thế lai tam bội. Phơng pháp nuôi cấy nội nhũ của hạt non đang đợc ứng dụng với cây ăn quả có múi để tạo giống cam quýt không hạt sạch bệnh. Mô của hạt non đã đợc quan sát dới kính hiển vi và tách thành các lát cắt mỏng để nuôi cấy. Mức bội thể của các lớp tế bào lát cắt đã đ ợc xác định trên máy Flow Cytometry theo quy trình của hãng Partec (Đức). Một số các lát cắt tế bào nuoi cấy đã tái sinh thành cụm chồi tam bội.
b. Cứu phôi:
+ Khi lai xa tạo hợp tử, hợp tử phát triển thành phôi, nhng phôi thờng yếu và không có khả năng sống. Nuôi cấy phôi, noãn invitro là phơng pháp khắc phục khó khăn khi lai xa.
+ Hiện tợng quả không hạt có thể do phôi sau khi hình thành đã không đợc tiếp tục phát triển mà tiêu biến đi. Phơng pháp mới tạo giống không hạt là lai 2 giống không hạt kiểu này với nhau, hạt lai trớc khi bị teo đi đã đợc tách ra nuôi cấy invitro để tái sinh thành cây. Đây là kỹ thuật nuôi cấy mô để cứu phôi invitro.
Mỗi năm, viện Hortialture ở Israel lai tạo và nuôi cấy khoảng 30.000 phôi non, tạo ra 30.000 cây con lai F1 để chọn giống nho không hạt.
c. Tạo giống đa bội thể 4n bằng sử lý consisin tế bào nhị bội trong ống nghiệm hoặc dung hợp các tế bào trần nhị bội với nhau, cây giống đa bội 4n sau khi tạo đợc bằng sử lý cosisin sẽ đ- ợc lai với giống nhị bội 2n để tạo giống tam bội không hạt (3n).
Ngoài ra trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào cũng có thể xuất hiện các biến đổi di truyền (đột biến gen, đột biến NST) và các biến đổi này đợc truyền cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào gọi là biến dị dòng Xoma.
Một số biến dị dòng Xoma có ích đã đợc phân lập và chọn lọc. Đó là khả năng đề kháng với virut Fijii, bệnh đốm vàng viền nâu, bệnh sơng mai ở mía, khoai tây, chịu hạn, chịu lạnh ở lúa,...