- Lựa chọn nguyên liệu: Lá Trầu đợc lựa chọn theo kinh nghiệm và cảm quan:
• Chọn lá bánh tẻ là loại có hoạt chất cao nhất. • Chọn lá Trầu to và dày.
• Màu sắc sáng bóng.
• Lá Trầu tơi, không chọn lá Trầu h hỏng. - Tách chiết dịch Trầu:
• Rửa thật sạch, để ráo nớc.
• Cân khối lợng trớc khi ngâm lá Trầu với dung môi là ethanol nguyên chất với tỷ lệ 1:1.
• Thái nhỏ, nghiền mịn.
• Lọc và vắt lấy nớc, sau đó cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 500C để làm bay hơi ethanol.
• Sau khi đợc làm khô Trầu không tiếp tục đợc hoà tan bằng ethanol, lọc qua giấy lọc 100àm và bảo quản ở nhiệt độ - 40C. 2.4.2. Quy trình sản xuất Bokashi Trầu
(1) Nguyên liệu: Lá Trầu, rỉ đờng, phụ gia sinh học và chế phẩm sinh học EM
(2) Sơ chế nguyên liệu:
+ Tạo dịch chiết lá Trầu: Nh trình bày ở trên. + Tạo dung dịch EM thứ cấp: (đờng 10%, cồn 1%) * Trộn rỉ đờng với nớc, hòa tan rỉ đờng hoàn toàn.
* Rót dung dịch hỗn hợp vào can nhựa đậy nút kín (đổ đầy can để duy trì điều kiện kỵ khí) bảo quản ở nơi ấm tránh ánh sáng mặt trời chiếu vào. EM thứ cấp có chất lợng tốt khi có mùi thơm ngọt (Mùi Ester / Rợu) (3) Phối trộn nguyên liệu:
- Trộn dịch chiết lá Trầu và EM thứ cấp tỉ lệ 1 : 1,5 (1 lít dịch chiết lá Trầu với dung môi : 1,5 lít EM thứ cấp).
- Cho hỗn hợp trên vào bình nhựa và đậy kín.
(4) Lên men: Nguyên liệu sau khi phối trộn sẽ đợc lên men. Lên men trong điều kiện yếm khí ở nhiệt độ 35 - 37 0C. Đây là giai đoạn ảnh hởng sâu sắc đến chất lợng sản phẩm nên quá trình này phải rất cận thận, nghiêm ngặt các thông số về công nghệ.
(5) Sản phẩm: Sau một ngày khi dung dịch có mùi men có thể sử dụng đợc.
Lá trầu Thái nhỏ Xay mịn với
dung môi
Vắt lấy dịch chiết
Lọc 100àm
Sấy khô dịch chiết ở 500C
Chiết xuất từ nư ớc cất Chiết xuất từ ethanol Sản phẩm dạng bột
Sơ đồ 2.1. Quy trình sản xuất Bokashi Trầu
2.5. Thí nghiệm khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết lá Trầu và Bokashi Trầu chiết lá Trầu và Bokashi Trầu
Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm xác định các nồng độ ức chế vi khuẩn của dịch chiết lá trầu theo phơng pháp nghiên cứu của Kishio Hatai và Nguyễn Ngọc Phớc (2006).
2.6. Phơng pháp kiểm tra vi sinh vật tổng số
Xác định số lợng vi sinh vật tổng trong mẫu nớc bằng phơng pháp xác định gián tiếp thông qua số lợng khuẩn lạc mọc trên môi trờng thạch đĩa [12, tr 218]. Số lựơng vi sinh vật trong mẫu nớc đợc xác định theo công thức:
N = M x Ax P Trong đó:
+ N: Tổng số lợng vi sinh vật
+ M: Số lợng khuẩn lạc trung bình trong một đĩa petri + A: Số giọt trong 1ml
+ P: Độ pha loãng
2.7. Thí nghiệm ảnh hởng của Bokashi Trầu lên đối t-ợng thuỷ ợng thuỷ
2.7.1.Các thông số thí nghiệm
Liều lợng Thời gian 1 1:A 1, A2 30 Đối chứng 0 2 2:B 1, B 2 30 Thí nghiệm 0,5ml 3:C 1, C 2 30 Thí nghiệm 1ml 4:D 1, D 2 30 Thí nghiệm 2ml - Thể tích bể thí nghiệm: 0,5 m3 - Yếu tố môi trờng:
• DO = 5 mg/l (đo bằng máy đo oxymeter) • pH = 6,5 - 8,5 (đo bằng test)
• Nhiệt độ nớc: 25-32 0C (đo bằng nhiệt kế) - Chế độ chăm sóc quản lý:
Cá cho ăn với lợng 8 - 10 % khối lợng đàn trong ngày, cho ăn ngày 2 lần (7 giờ và 16 giờ), sục khí liên tục 24 giờ, xiphon đáy khi nớc bẩn và đáy có nhiều chất thải, thức ăn thừa lắng đọng đối với tất cả các bể.
Hằng ngày theo dõi các bể cá xem tình hình sức khoẻ, hoạt động sống, lợng cá chết.
2.7.2. Phơng pháp xác định các thông số thí nghiệm+ Các chỉ tiêu sinh học + Các chỉ tiêu sinh học
- Dùng vợt vớt 30 con tiến hành cân, đo.
- Trớc thời điểm thí nghiệm cân khối lợng và đo chiều dài tổng số của cá (từ mút môi đến vây đuôi dài nhất) của mỗi lô riêng rẽ để lấy khối lợng, chiều dài thân trung bình trớc thí nghiệm.
- Định kỳ 10 ngày tiến hành cân khối lợng, đo kích thớc chiều dài tổng số của các lô, lấy kết quả trung bình, đánh giá tốc độ tăng trởng của cá tại các thời điểm nuôi khác nhau.
- Đo chiều dài cá bằng thớc đo ml. - Cân khối lợng cá bằng cân điện tử.
+ Giá trị trung bình: X = n 1 ∑ = n i X 1 i
Trong đó: X : Giá trị trung bình
X : Giá trị thứ i của biến X (X là giá trị của lô thứ i ) n: Số cá thể thí nghiệm trong 1 lô
+ Tốc độ tăng trởng chiều dài thân: Ltbi + 1 - Ltbi
Ll(%) = *100 Ltbi
+ Tốc độ tăng trởng khối lợng thân Wtbi+1 - Wtbi
Ww(%) = * 100 Wtbi
Trong đó: Ll(%),Ww(%): Tốc độ tăng trởng theo chiều dài và khối lợng
Ltbi(cm), Wtbi(g): Chiều dài và khối lợng cá tại thời điểm trớc Ltbi + 1(cm), Wtbi + 1(g) Chiều dài và khối lợng cá tại thời điểm sau.
+ Các yếu tố môi trờng
Độ tiêu hao oxy hoá học COD (Chemical Oxygen Demand) và nhu cầu oxy sinh hoá BOD (Biological Oxygen Demand) đợc xác định định kỳ 5 ngày/ lần. Với 9 mẫu nớc:
+ 1 mẫu nớc trớc khi nuôi (mẫu nớc ở bể lọc). + 2 mẫu nớc ở 2 lô cá đối chứng (A1, A2).
+ 2 mẫu nớc ở 2 lô thí nghiệm với lợng dịch chiết lá Trầu 0,5ml (B1, B2). + 2 mẫu nớc ở 2 lô thí nghiệm với lợng dịch chiết lá Trầu 1ml (C1, C2). + 2 mẫu nớc ở 2 lô thí nghiêm với lợng dịch chiết lá trầu 2ml (D1, D2)
Tiến hành thu mẫu 5 ngày một lần kể từ khi bổ sung dịch chiết lá Trầu hoặc Bokashi Trầu vào. ở các lô đối chứng hay lô thí nghiệm với lợng dịch chiết lá Trầu giống nhau ta lấy giá trị trung bình [20].
- Phơng pháp đo COD và BOD5: Theo phơng pháp của Nguyễn Đức Bình, 2006, RIA – No- I [2].
- Công thức tính kết quả:
+ COD: X (mg O2/l) = 8 x (B – A) Trong đó:
A: Lợng KMnO4 tiêu chuẩn đã dùng cho bình nớc cất B: Lợng KmnO4 tiêu chuẩn đã dùng cho bình nớc mẫu
+ BOD5: BOD5 (mg O2/l) = Oxy ban đầu – Oxy sau 5 ngày.
2.8. Phơng pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel.
2.9. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ ngày 5/ 5/ 2008 đến ngày 5/ 10/ 2008. Địa điểm nghiên cứu:
+ Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Chơng 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Kết quả thí nghiệm với dịch chiết lá trầu
3.1.1. Kết quả thí nghiệm sàng lọc nồng độ ức chế trên vi khuẩn A.
hydrophyla và vi khuẩn V. parahaemolyticus của dịch chiết lá trầu
Thí nghiệm đợc tiến hành riêng rẽ đối với hai chủng vi khuẩn. Với việc sử dụng số lợng vi khuẩn cố định 106CFU/ml cho tất cả các nồng độ, sau khi cho tiếp xúc với các nồng độ dịch chiết lá Trầu khác nhau và tiến hành nuôi cấy trên môi trờng đặc hiệu kiểm tra số lợng vi khuẩn. Kết quả giống nhau trên 2 chủng vi khuẩn và đợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc nồng độ chất chiết lá Trầu có khả năng ức chế 2 chủng vi khuẩn A. hydrophyla và V. parahaemolyticus
Nồng độ (ppm)
Số lợng vi khuẩn
thí
Số lợng vi khuẩn kiểm tra trong thời gian thí nghiệm
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày Dịch chiết lá 100.000 106 CFU / ml 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 10.000 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 1000 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 100 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 1x105 10 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 0 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 Ethanol 1% 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106
- Với nồng độ dịch chiết lá Trầu từ 1000 đến 100.000ppm đều có khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophyla và vi khuẩn V. parahaemolyticus.
- Vi khuẩn đã bị ức chế không có khả năng phát triển đợc trên môi trờng BA đặc hiệu sau 7 ngày nuôi cấy.
- Nồng độ dịch chiết lá Trầu từ 10 đến 100 ppm không có khả năng ức chế 2 chủng vi khuẩn.
- Lô đối chứng âm tức nồng độ dịch chiết lá Trầu 0 ppm và lô đối chứng dơng tức nồng độ ethanol 1% không làm ảnh hởng đến sự phát triển của vi khuẩn vi khuẩn A. hydrophyla và vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Nh vậy, dịch chiết lá Trầu từ khoảng nồng độ 1000 ppm trở lên có khả năng ức chế cả vi khuẩn V. parahaemolyticus và vi khuẩn A. hydrophyla. Kết quả khảo nghiệm của chúng tôi đạt đợc tơng tự với kết quả của Nguyễn Ngọc Phớc công bố năm 2007.
3.1.2. Kết quả thí nghiệm xác định các nồng độ ức chế vi khuẩn của dịch chiết lá trầu chiết lá trầu
Dựa vào kết quả sàng lọc ở trên, trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ bố trí thí nghiệm với 4 nồng độ dịch chiết lá Trầu khác nhau: 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm và 125 ppm. Thời gian cho vi khuẩn tiếp xúc với dịch chiết lá Trầu sau: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 24 giờ rồi tiến hành nuôi cấy hỗn dịch trên môi trờng BA và theo dõi sự phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau.
* Xác định nồng độ dịch chiết lá Trầu về khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophyla.
Bảng 3.2. Kết quả thí nghiệm tìm nồng độ chất chiết lá Trầu thích hợp có khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophyla
Nồng độ (ppm) Số lợng vi khuẩn
Số lợng vi khuẩn kiểm tra trong thời gian thí nghiệm
500 1x106 1x105 0x 100 0x100 0x100 0x100 0x100 250 1x106 1x105 1x103 0x100 0x100 0x100 0x100 125 1x104 1x103 1x102 1x101 1x101 1x101 1x101 Qua bảng trình bày kết quả ta thấy:
- Dịch chiết lá Trầu không có tác dụng tức thì đối với vi khuẩn A. hydrophyla sau 10 phút mà phải sau 20 phút dịch chiết lá Trầu mới bắt đầu phát huy tác dụng ức chế vi khuẩn. Nồng độ dịch chiết lá Trầu tăng thì khả năng ức chế vi khuẩn A. Hydrophyla tăng.
- Nồng độ dịch chiết lá Trầu 125 ppm không có khả năng ức chế triệt để vi khuẩn A. hydrophyla. Sau 40 phút cho vi khuẩn tiếp xúc với dịch chiết lá Trầu vẫn còn số lợng 1.101 CFU/ml vi khuẩn A. Hydrophyla phát triển đợc ở trên môi trờng nuôi cấy.
- Nồng độ 500 ppm sau 30 phút đã không phát hiện đợc vi khuẩn nào khi nuôi cấy. Còn ở nồng độ 250 ppm phải sau 40 phút tiếp xúc giữa vi khuẩn và dịch chiết lá Trầu mới đạt đợc khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn A. Hydrophyla.
Vậy: Dùng dịch chiết lá Trầu với nồng độ 500 ppm sau 30 phút có khả năng ức chế đợc vi khuẩn A. Hydrophyla. Song để giảm giá thành sản phẩm nuôi trồng thủy sản chúng ta có thể dùng dịch chiết lá Trầu ở nồng độ 250 ppm.
* Xác định nồng độ dịch chiết lá Trầu về khả năng ức chế đối với vi khuẩn V.parahaemolyticus.
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm tìm nồng độ chất chiết lá Trầu thích hợp về khả năng ức chế vi khuẩn V.parahaemolyticus
Nồng độ (ppm)
Số lợng vi khuẩn
Số lợng vi khuẩn kiểm tra trong thời gian thí nghiệm 10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phút 24 giờ Dịch 1.000 106 1x106 0x105 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 500 1x106 1x105 0x104 0x100 0x100 0x100 0x100 250 1x106 1x106 1x105 0x102 0x100 0x100 0x100 125 1x104 1x103 1x102 1x102 1x101 1x101 1x101
So với kết quả thí nghiệm nồng độ ức chế của dịch chiết lá trầu đối với vi khuẩn A. Hydrophyla ta thấy vi khuẩn V.parahaemolyticus có độ nhạy kém hơn. Nồng độ 500 ppm sau 40 phút đã không phát hiện đợc vi khuẩn nào khi nuôi cấy. Còn ở nồng độ 250 ppm phải sau 50 phút tiếp xúc giữa vi khuẩn và dịch chiết lá Trầu mới đạt đợc khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn
V.parahaemolyticus .
Từ nhận xét trên rút ra kết luận: Dùng dịch chiết lá Trầu với nồng độ 500 ppm sau 30 phút có khả năng ức chế đợc vi khuẩn A. Hydrophyla, sau 40 phút có khả năng ức chế đợc vi khuẩn V. parahaemolyticus, với nồng độ 250 ppm có khả năng ức chế 2 chủng vi khuẩn trên sau 10 phút so với nồng độ 500 ppm. Vậy để giảm giá thành sản phẩm nuôi trồng thủy sản chúng ta có thể dùng dịch chiết lá Trầu ở nồng độ 250 ppm.
Nh vậy có thể xem dịch chiết lá Trầu là một chất kháng khuẩn. Kết quả thí nghiệm cho thấy dịch chiết lá Trầu đợc chiết xuất với dung môi là ethanol có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn A. hydrophyla và vi khuẩn V. parahaemolyticus
rất tốt. Theo Võ Văn Chi (2000), trong dịch chiết lá Trầu gồm chủ yếu là hai phenol: Betel - phenol là đồng phân của eugonol và chavicol kèm theo nhiều hợp chất phenolic khác, chúng có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng.
3.2. Kết quả thí nghiệm phối hợp giữa em và dịch chiết lá Trầu (Bokashi Trầu) Trầu (Bokashi Trầu)
Với mục đích làm sao một sản phẩm dùng cho nuôi trồng thủy sản có nhiều tác dụng, giảm tối đa giá thành, dễ sử dụng và có hiệu quả nhất. Chúng tôi đã tiến hành phối hợp giữa chế phẩm EM với dịch chiết lá Trầu để tạo sản phẩm Bokashi Trầu. Việc phối hợp một chất có hoạt tính kháng sinh thực vật vào với vi khuẩn có lợi đơng nhiên là không thể nào đa vào lợng lớn dịch chiết lá Trầu, do đó chỉ cần một lợng nhỏ để có tác dụng hiệp đồng, song nếu có
3.2.1. Kết quả sàng lọc nồng độ dịch chiết lá Trầu trong Bokashi Trầu ức chế trên 2 chủng vi khuẩn A. hydrophyla và V. parahaemolyticus. chế trên 2 chủng vi khuẩn A. hydrophyla và V. parahaemolyticus.
Với nồng độ dịch chiết lá Trầu đợc xác định trong thể tích nhất định, chúng tôi lấy lợng dịch chiết lá Trầu cho vào dung dịch EM thứ cấp sao cho vi sinh vật tổng số của toàn bộ dung dịch đạt 106 CFU/ml. Các bớc tiến hành thí nghiệm sàng lọc các nồng độ ức chế 2 loại vi khuẩn gây bệnh của Bokashi Trầu tơng tự nh thí nghiệm sàng lọc dịch chiết lá Trầu ở trên, nhng với nồng độ dịch chiết lá Trầu từ 500 ppm trở xuống. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế vi khuẩn A. hydrophyla giống so với kết quả sàng lọc nồng độ ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus của chế phẩm Bokashi Trầu.
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc nồng độ dịch chiết lá Trầu về khả năng ức chế 2 loại vi khuẩn A. hydrophyla và V. parahaemolyticus của chế phẩm Bokashi Trầu
Nồng độ (ppm)
Số lợng vi Số lợng vi khuẩn kiểm tra trong thời gian thí nghiệm 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày Dịch 500 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 250 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 50 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 0x100 10 1x106 1x104 1x104 1x104 1x104 1x104 1x104 0 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 1x106 Thông qua kết quả nghiên cứu sàng lọc nồng độ ức chế vi khuẩn của Bokashi trầu chúng tôi có nhận xét sau:
- Khi phối trộn dịch chiết lá Trầu vào dung dịch EM thứ cấp tạo dung dịch Bokashi Trầu vẫn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh A. hydrophyla và
V. parahaemolyticus.
- Khả năng ức chế vi khuẩn của dung dịch Bokashi Trầu tốt hơn so với dịch chiết lá Trầu.
- Có thể tìm nồng độ dịch chiết lá Trầu để phối trộn với EM thứ cấp ở khoảng từ 10 ppm đến 50 ppm.
- Tơng tự nh thí nghiệm đối với dịch chiết lá Trầu đơn nhất ở trên, dung dịch Bokashi Trầu có khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophyla và V. parahaemolyticus khá triệt để, vi khuẩn gây bệnh đã không phát triển đợc sau