2.1.1. Dụng cụ.
Các dụng cụ thuỷ tinh đo thể tích nh pipet, micropipet, buret, microburet, bình định mức, cốc thuỷ tinh, phễu chiết có thể tích khác nhau đều đợc ngâm rửa kĩ bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng rửa bằng nớc cất một lần và hai lần trớc khi tiến hành thí nghiệm.
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu.
+ Cân phân tích điện tử Sartorius.
+ Máy đo pH Orion – 420 (Mỹ) đợc chuẩn hoá bằng các dung dịch chuẩn có pH = 4,00 và pH = 7,00 hàng ngày trớc khi đo.
+ Máy ghi phổ tự động Agilent 8453, máy đo mật độ quang Sphectrophotometer 6300- Zenway, cuvet thạch anh có bề dày 1,001cm.
+ Máy chụp phổ hồng ngoại VERTEX 70 (BRUKER).
+ Tính toán và xử lý số liệu bằng chơng trình MS - Excel và phần mềm đồ hoạ Matlab 7.2.
2.2. Pha chế hoá chất.
Tất cả các hoá chất sử dụng trong luận văn đều thuộc loại tinh khiết hoá học hoặc tinh khiết phân tích, nớc cất hai lần.
2.2.1. Dung dịch gốc Fe3+ (10-3M)
Cân chính xác 0,270g FeCl3.6H2O kim loại tinh khiết trên cân phân tích,
bình định mức một lít, lắc đều, rồi định mức đến vạch ta đợc dung dịch Fe3+ 10-3M.
Các dung dịch Fe3+ có nồng độ bé hơn đợc pha từ dung dịch này. Nồng độ dung
dịch Fe3+ đợc kiểm tra lại nồng độ bằng phơng pháp chuẩn độ complexon với
EDTA 0,1M dùng chỉ thị axit sufosalixilic.
2.2.2. Dung dịch gốc Streptomycin (10-3M)
Cân chính xác 0,1457g streptomycin, sau đó hoà tan hoàn toàn bằng nớc cất, chuyển vào bình định mức 1 lít, tráng cốc, thêm nớc cất hai lần tới vạch, lắc kĩ
ta đợc dung dịch chuẩn streptomycin (10-3M). Các dung dịch có nồng độ thấp hơn
đợc pha loãng trớc khi dùng.
2.2.3. Dung dịch NaOH (1M)
Cân 4g NaOH, hoà tan hết trong cốc thuỷ tinh, chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng nớc cất hai lần, lắc kĩ ta đợc dung dịch NaOH (1M). Các dung dịch có nồng độ thấp hơn đợc pha loãng trớc khi dùng.
2.2.4. Dung dịch hoá chất khác
Dung dịch NaNO3 1M sử dụng để điều chỉnh lực ion à = 0,1 đợc pha chế
bằng cách cân chính xác một lợng NaNO3 theo tính toán ứng với nồng độ 1M, hoà
tan và chuyển vào bình định mức, thêm nớc cất hai lần đến vạch và lắc đều.
Các dung dịch sử dụng để điều chỉnh pH: NaOH và HNO3 với các nồng độ
khác nhau đợc pha chế từ lợng cân và thể tích tơng ứng.
2.3. Cách tiến hành thí nghiệm 2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu thịt cần phân tích đợc thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lợng a = 20g cho vào máy xay sinh tố. Thêm 10 ml nớc cất vào và cho máy chạy trong 5 phút. Cho 5 ml axit clohydric 1 M vào và định mức đến 50 ml bằng nớc cất. Đun trong bếp cách thủy sôi trong 10 phút. Để nguội ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch n- ớc trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tớng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml NaOH 1M và 4ml thuốc thử sắt (III) trong axit và
nớc cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nớc. Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bớc sóng 525 nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2. Pha dãy chuẩn
Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunfat nồng độ 1mg/ml, tính toán lợng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 – 0,5 – 1,0
– 1,5 - 2,0 – 2,5 àg/ml trong các bình định mức có thể tích 20 ml sau đó thủy
phân bằng kiềm, đun cách thủy cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho 2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amoni 1%, định mức bằng nớc cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo.
2.3.3. Mẫu trắng
Mẫu trắng phải đợc chuẩn bị cùng một điều kiện nh mẫu phân tích nhng thay thể tích mẫu bằng thể tích nớc cất tơng ứng.
+ Nghiên cứu các điều kiện tối u cho sự thủy phân streptomycin tạo ra
maltol nh : thời gian thủy phân, nhiệt độ, nồng độ NaOH.
+ Nghiên cứu hiệu ứng tạo phức giữa Fe3+ với maltol.
+ Nghiên cứu các điều kiện tối u cho sự tạo phức nh: thời gian tạo phức tối - u (tt), pH tối u (pHt), nồng độ thuốc thử tối u...
+ Xác định thành phần, cơ chế phản ứng và các tham số định lợng của phức (hệ số hấp thụ phân tử, hằng số bền điều kiện...), khảo sát khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer.
+ áp dụng kết quả nghiên cứu vào việc xác định d lợng streptomycin trong thịt lợn.
2.3.4. Tiến hành thử
+ Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút).
+ Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bớc sóng 525 nm bằng cuvét có chiều dày 1 cm. Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần.
+ Lập đồ thị đờng chuẩn theo hệ tọa độ A – C. Trong đó A là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tơng ứng.
+ Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đờng chuẩn đã dựng đợc.
2.3.5. Tính kết quả
Hàm lợng của streptomycin trong mẫu phân tích đợc tính theo công thức sau : 0 . x C V C a = Tính bằng mg/kg Trong đó: a là lợng mẫu cân V là thể tích pha mẫu (V=25ml) 2.4. Xử lý các kết quả thực nghiệm
+ Giản đồ phân bố các dạng tồn tại của Fe3+, thuốc thử maltol đợc xử lý
bằng phần mềm đồ hoạ Matlab 7.2.
+ Cơ chế phản ứng tạo phức, phơng trình đờng chuẩn và các tham số định l- ợng của phức đợc tính toán, xử lý trên máy tính bằng chơng trình descriptive statistic, regression trong phần mềm Ms - Excel.
Chơng 3
Kết quả thực nghiệm và thảo luận
3.1. Nghiên cứu sự tạo phứC TRONG hệ Fe3+- MalTOL.
3.1.1. Nghiên cứu hiệu ứng tạo phức.
Chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ electron của thuốc thử maltol,
phức Fe3+- maltol ở các điều kiện tối u, bằng cách chuẩn bị các dung dịch trong
các bình định mức 25ml nh sau: Chuẩn bị các dung dịch:
Dung dịch so sánh: CMaltol = 6.10-3 M, CNaCl = 0,1 M Dung dịch phức Fe3+- maltol ở pH=0,9 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CFe3+ = 3.10-3 M, CMaltol = 6.10-3 M, CNaCl = 0,1 M.
Tiến hành đo phổ hấp thụ electron của phức Fe3+-maltol trên thiết bị máy
đo, kết quả đợc trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1:
Bảng 3.1: Số liệu phổ hấp thụ electron của phức Fe3+- maltol ( l=1,001cm, à =0,1pH=5,30) λ(nm) Ai λ(nm) Ai λ(nm) Ai 250 -0,132 355 0,135 455 0,031 255 -0.112 360 0,112 460 0,035 260 -0,100 365 0,109 465 0,037 265 -0,084 370 0,094 470 0,069 270 -0,045 375 0,089 475 0,113 275 -0,028 380 0,078 480 0,185 280 0,004 385 0,061 485 0,197 285 0,015 390 0,055 490 0,213 290 0,032 395 0,052 495 0,224 300 0,043 400 0,500 500 0,232 305 0,078 405 0,049 505 0,241 310 0,098 410 0,046 510 0,254 315 0,105 415 0,044 515 0,260 320 0,123 420 0,043 520 0,261 325 0,134 425 0,042 525 0,261 330 0,140 430 0,039 530 0,232 335 0,132 435 0,036 535 0,221 340 0,112 440 0,029 540 0,213 345 0,117 445 0,022 545 0,198
350 0,121 450 0,029 550 0,123 Phổ hấp thụ của phức và thuốc thử đợc trình bày trên hình 3.1 và hình 3.2:
Hình 3.1: Phổ hấp thụ electron của phức đơn ligan Fe (III) Maltol.–
Bảng 3.2: Bớc sóng hấp thụ cực đại của maltol và phức đơn ligan Fe(III) maltol
–
Dung dịch nghiên
cứu λmax(nm) ∆λmax(nm) ε Ai
Maltol 505
20 1496,6 0,0898
Fe3+- Maltol 525 4355 0,2613
Từ bảng 3.2 và hình 3.1; 3.2 chúng tôi rút ra các nhận xét: - Có hiện tợng tạo phức trong dung dịch.
- Phức Fe3+ - matol có sự chuyển λmax về vùng sóng dài hơn so với thuốc thử maltol. Khi có mặt của Fe3+ dù sự dịch chuyển λmax không nhiều nhng giá trị mật độ quang đã tăng lên 2,91 lần. Từ đó cho thấy có thể dùng Fe3+ cho phép phân tích trắc quang xác định maltol.
Phổ của phức Fe3+- maltol hấp thụ cực đại ở bớc sóng cực đại λmax = 523nm, nên chúng tôi chọn λmax = 525nm làm bớc sóng đo để nghiên cứu các quá trình tiếp theo.
3.1.2. Nghiên cứu điều kiện ảnh hởng đến sự thuỷ phân streptomycin
Chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ electron của phức Fe3+ - maltol
bằng cách chuẩn bị các dụng dịch streptomycin gốc (5.10-3M) trong các bình định
mức 25ml, sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội
rồi cho 2ml dung dịch thuốc thử sắt (III) (10-3M), định mức bằng nớc cất đến
25ml. Đo mật độ quang sau 20 phút.
3.1.2.1. ảnh hởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân Streptomycin.Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân streptomycin đợc tiến hành trong điều kiện nồng độ NaOH là 0,5M, thời gian thuỷ phân là 15 phút, còn nhiệt độ đun đợc thay đổi từ 500C đến 1000C.
Để biết quá trình thuỷ phân streptomycin hoàn toàn hay cha hoàn toàn, chúng tôi sử dụng phơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để xác định.
Thí nghiệm 1:
CFe3+ = 10-3 M
Thời gian thuỷ phân: 15 phút
Nồng độ NaOH: CM NaoH = 0,5M
Nhiệt độ đun: 500C
Dung dịch sau khi thuỷ phân cho 2 vết trên bản mỏng, trong đó có 1 vết trùng với streptomycin gốc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để biết vết còn lại là maltol hay không, ta cho tạo phức với Fe(III) ở điều kiện pH = 0,5. Kết quả cho thấy cha có sự tạo phức màu tím đỏ Fe3+ - maltol. Điều này chứng tỏ quá trình thuỷ phân cha hoàn toàn.
Thí nghiệm 2:
CFe3+ = 10-3 M
CStreptomycin = 5.10-3M
Thời gian thuỷ phân: 15 phút
Nồng độ NaoH: CM NaoH = 0,5M
Nhiệt độ đun: t0 = 700C
Dung dịch sau khi thuỷ phân cho 4 vết: Có 1 vết trùng với streptomycin. Dung dịch sau thuỷ phân đợc xác định bằng
cách cho phản ứng tạo phức màu Fe3+ - maltol. Kết quả cho thấy có sự tạo phức màu tím đỏ, tiến hành do mật độ quang ở bức sáng 525mm; đợc giá trị A = 0,177
Thí nghiệm 3: Nhiệt độ đun 900C
Dung dịch sau khi thuỷ phân cho 4 chấm: A = 0,205
Thí nghiệm 4: Nhiệt độ đun 1000C
Sắc ký lớp mỏng dung dịch sau thuỷ phân cho 3 chấm không có chấm nào trùng với streptomycin.
Hình 3.3: Sắc đồ của dung dịch tr- ớc và sau khi thủy phân
Hình 3.4: Sắc đồ của dung dịch trớc và sau khi thủy phân
Dung dịch sau thuỷ phân đợc tiến hành cho tạo phức với dung dịch Fe3+ (5.10-3M) ở điều kiện pH = 0,5, phức tạo thành có màu tím đỏ, tiến hành đo mật độ quang cho ta: A = 0,261
Bảng3.3: ảnh hởng của nhiệt độ đun nóng đến quá trình thủy phân Streptomycin. TT Nhiệt độ đun (t0C) A (λ = 525nm) 1 50 0,007 2 70 0,177 3 90 0,205 4 100 0,261
Hình 3.6: ảnh hởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân streptomycin. Hình 3.5: Sắc đồ của dung dịch tr-
Từ các kết quả trên: Nếu thuỷ phân ở t0 = 50 - 700C thì quá trình thuỷ phân cha sinh ra maltol. Nếu ở nhiệt độ cao hơn thì quá trình thuỷ phân streptomycin bắt đầu tạo ra maltol, nhng tại t0 = 1000C thì mật độ quang của phức tạo thành là lớn nhất. Vì vậy trong quá trình tiếp theo chúng ta tiến hành với điều kiện nhiệt độ thuỷ phân là 1000C.
3.1.2.2. ảnh hởng của thời gian đun nóng đến quá trình thuỷ phân streptomycin. streptomycin.
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân
streptomycin đựơc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ đun là 1000C, nồng độ
NaOH là 0,5M. Thời gian thuỷ phân đợc thay đổi từ 5 phút đến 25 phút. Kết quả đợc trình bày ở bảng3.4 và hình3.7:
Bảng3.4: ảnh hởng của thời gian đun nóng dến quá trình thủy phân streptomycin.
STT Thời gian đun nóng
(phút) A (λ = 525nm) 1 5 0,085 2 10 0,151 3 12 0,235 4 14 0,255 5 15 0,261 6 16 0,254 7 17 0,24 8 20 0,187 9 25 0,112
Hình3.7: ảnh hởng của thời gian đun nóng dến quá trình thủy phân streptomycin.
Từ các kết quả: Trong cùng điều kiện về nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian phản ứng tăng thì hiệu suất phản ứng thuỷ phân streptomycin tăng theo và đến khoảng 15 phút thì đạt thời gian tối u cho phản ứng thuỷ phân, điều đó có thể đợc giải thích do maltol tạo thành có vòng pyron là kém bền nhiệt nên xảy ra sự mở vòng. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian 15 phút để khảo sát các thí nghiệm sau.
3.1.2.3. ảnh hởng của nồng độ NaOH đến quá trình thuỷ phân streptomycin.
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng nồng độ NaOH đến sự thuỷ phân streptomycin cũng đợc tiến hành nh trên, với nồng độ ban đầu của streptomycin là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(10-3M) thời gian phản ứng là 15 phút, nhiệt độ phản ứng là 100C, nồng độ NaOH
đợc thay đổi từ 0,2M đến 1,5M
Kết quả nghiên cứu đựơc trình bày trên bảng3.5 và hình3.8:
STT Nồng độ NaOH (CM) A (λ = 525nm) 1 0,2 0,142 2 0,4 0,187 3 0,5 0,261 4 0,6 0,251 5 1 0,152 6 1,5 0,023
Hình3.8: ảnh hởng của nồng độ NaOH đến quá trình thủy phân streptomycin.
Với kết quả thể hiện ở hình cho thấy khi tăng nồng độ NaOH thì hiệu suất phản ứng thuỷ phân streptomycin tăng theo, nhng khi nồng độ NaOH tăng quá 1M thì hiệu suất phản ứng thuỷ phân streptomycin lại giảm, điều này đợc giải thích do trong vùng nồng độ NaOH quá cao đã xảy ra sự phân cách cắt các liên kết trong các hợp chất tạo thành.
Còn ở nồng độ NaOH quá cao (1,5M) thì lại xảy ra phản ứng tạo kết tủa Fe(OH)3 cạnh tranh với phản ứng tạo phức màu của Fe3+ - Maltol. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ NaOH là 0,5M làm điều kiện nghiên cứu cho các thí nghiệm sau.
3.1.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hởng đến sự tạo phức màu Fe3+ - maltol. maltol.
3.1.3.1. ảnh hởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng tạo phức Fe3+ - maltol maltol
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
tạo phức Fe3+ - maltol đựơc tiến hành trong điều kiện nồng độ ban đầu của
Streptomycin là (5.10-3M), thời gian thuỷ phân streptomycin cho ra maltol là 15
phút, nhiệt độ phản ứng thuỷ phân streptomycin là 1000C, nồng độ NaOH cần để
tạo môi trờng cho phản ứng thuỷ phân streptomycin là 0,5M, thuốc khử Fe3+
10-3M, thời gian phản ứng đợc thay đổi từ 5 phút đến 30 phút. Kết quả khảo sát đợc trình bày ở bảng3.6 và hình3.9:
Bảng3.6: Sự phụ thuộc mật độ quang của phức vào thời gian
STT Thời gian (phút) A (λ = 525nm) 1 5 0,145 2 10 0,242 3 15 0,255 4 20 0,261 5 25 0,261 6 30 0,261
Hình3.9: Sự phụ thuộc mật độ quang của phức vào thời gian
Từ hình vẽ cho thấy, trong cùng điều kiện về nhiệt độ, thời gian phản ứng tạo phức tăng thì hiệu suất phản ứng tăng theo và đến khoảng sau 20 phút thì đạt
thời gian tối u cho hiệu suất phản ứng tạo phức là cao nhất. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian 20 phút để khảo sát các thí nghiệm sau.
3.1.3.2. ảnh hởng của pH đến hiệu suất của phản ứng tạo phức
Thí nghiệm đựơc tiến hành với các điều kiện nh trên với pH của môi trờng phản ứng đợc thay đổi từ 0,5 đến 2. Kết quả khảo sát đựơc trình bày trên bảng3.7 và hình3.10:
Bảng3.7: Sự phụ thuộc mật độ quang của phức vào pH
STT pH A (λ = 525nm) 1 0,5 0,242 2 0,7 0,261 3 0,9 0,260 4 1,0 0,178 5 1,2 0,115 6 1,5 0,042 7 2,0 0,025
Hình3.10: Sự phụ thuộc mật độ quang của phức vào pH
Qua bảng và hình vẽ cho thấy, trong các giá trị pH đã khảo sát thì hiệu suất phản ứng tạo phức tối đa trong khoảng giá trị pH = 0,5 đến 0,9. Điều này có thể đ- ợc giải thích ở pH = 0,5 ữ 0,9 thì phản ứng tạo phức giữa maltol và Fe(III) đạt hiệu
suất tối u, phức tạo thành bền vững, còn ở pH ≥1 thì có sự cạnh tranh trong việc tạo phức hyđroxo của ion Fe3+.
3.2. Khảo sát thành phần phức Fe3+ - Maltol