Nguyờn tắc: Hoạt tớnh hệ enzyme chitinase được xỏc định dựa trờn phương phỏp định lượng sản phẩm N - acetyl - D- Glucosamin của quỏ trỡnh phõn giải chitin.
Cỏch tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phự chitin 1%
Do đặc tớnh của chitin khụng tan trong nước nờn để tiến hành xỏc định hoạt độ của enzyme chitinase cần huyền phự húa chitin.
Lấy 5g chitin hũa tan trong 50 ml HCl đậm đặc. Khuấy liờn tục trong thời gian
3 phỳt ở 40oC. Sau đú tạo chitin huyền phự bằng cỏch thờm từ từ nước lạnh (5oC) đến
500ml.
Dịch huyền phự được thu lại bằng cỏch lọc qua giấy lọc hoặc ly tõm (3500 vũng/ phỳt). Huyền phự được rửa với nước cất nhiều lần cho đến pH đạt khoảng 5,0. Sau đú bảo quản lạnh dịch huyền phự.
Hỡnh 2.3. Chitin huyền phự 1% Bước 2: Xỏc định hoạt tớnh enzyme chitinase
Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml dịch huyền phự chitin 1% +1ml dịch enzyme.
Hỗn hợp được ủ ở 30oC trong 20 phỳt, phản ứng được ngừng lại bằng cỏch
đun sụi trong 3 phỳt.
Lượng glucosamin tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xỏc định theo phương phỏp Elson - Morgan.
Cỏch tớnh kết quả:
Một đơn vị hoạt tớnh (đvht) của enzyme chitinase tương ứng với 1àg
glucosamin tạo ra trong thời gian thủy phõn chitin 1 phỳt ở nhiệt độ phản ứng.
Hoạt tớnh chitinase (đvht/ml dịch mụi trường) = aV*n**TV
2 1
Trong đú:
a: là hàm lượng glucosamin (àg/ml) trong dịch thớ nghiệm.
n: là hệ số pha loóng. Do hoạt tớnh enzyme chitinase thu được khi nuụi cấy lỏng của chủng Trichoderma thường khụng cao nờn trong cỏc khảo sỏt sử dụng n = 1.
V1: là thể tớch dịch enzyme ban đầu (ml). V1 = 2ml. V2: là thể tớch dịch enzyme thớ nghiệm (ml). V2 = 1ml T: là thời gian phản ứng (phỳt), T = 20 phỳt