3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.5.2 Phương phỏp xỏc ủịnh sự lan truyền của virus khảm ủốm gõn lỏ ớt
(ChiVMoV) bằng tiếp xỳc cơ học
Phương phỏp xỏc ủịnh sự lan truyền của virus khảm ủốm gõn lỏ ớt (ChiVMoV) bằng tiếp xỳc cơ học dựa theo tài liệu mụ tả của Green (1991)[37], Vũ Triệu Mõn (2003)[13] và [17].
3.5.2.1 Giỏ thểủể gieo cõy chỉ thị, cõy ký chủ phụ
ðất phự sa ủược hấp khử trựng trong nồi hấp chuyờn dụng ở nhiệt ủộ từ
115 ủến 1200C trong thời gian 45 phỳt ủể tiờu diệt cỏc nguồn bệnh vi sinh vật và cỏc sinh vật khỏc cú trong ủất thớ nghiệm. ðất sau khi ủó ủược hấp khử
trựng ủược bổ sung phõn bún vi sinh và vỏ trấu hun tạo ủược giỏ thể dựng ủể
gieo trồng cõy chỉ thị. Cõy chỉ thị ủược gieo trồng, chăm súc cẩn thận. Khi cõy lớn, ủạt số lỏ thật nhất ủịnh thỡ tiến hành lõy nhiễm nhõn tạo. Với cõy thuốc lỏ ủạt 4 - 6 lỏ thật, cõy rau muối và cỏc cõy khỏc cú từ 7 - 10 lỏ thật.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24
3.5.2.2 Cõy chỉ thị và cõy ký chủ phụ
Hạt cõy chỉ thị dựng trong thớ nghiệm do Trung tõm Bệnh cõy nhiệt ủới cung cấp cú nguồn gốc từ Nhật Bản, ðan Mạch và Australia.
Một số cõy cỏ dại ủược thu thập từủồng ruộng.
Danh phỏp tờn gọi, phõn loại thực vật thành phần cõy thớ nghiệm dựa theo tài liệu mụ tả của Dương Văn Chớn và CS (2000)[5], Wikipedia tiếng Việt (2006)[20], Hoàng Thị Sản (2009)[16].
Thành phần cõy thớ nghiệm:
* Họ Rền Amaranthaceae: Dền xanh Amaranthus viridis L.; nở ngày
ủất Gomphrena globosa L.
* Họðu ủủ Caricaceae: ðu ủủCarica papaya L.
* Họ Bầu bớ Cucurbitaceae: Dưa chuột Cucumis sativus L.; bớ ngụ
Cucurbita pepo L.; bầu Lagenaria vulgaris Ser.; mướp hương Luffa acutangula (L.) Roxb.
* Họ Rau muối Chenopodiaceae: Rau muối thõn tớm Chenopodium amaranticolor Coste.; rau muối hoang dại Chenopodium album L.; rau muối trắng Chenopodium quinoa Willd.
* Họðậu Fabaceae: ðậu cụ ve Phaseolus vulgaris L.; ủậu ủũa quả dài
Vigna sesquipedalis Wight.
* Họ Bụng Malvaceae: Bụng trồng Gossypium hirsutum L.
* Họ Cà Solanaceae: Ớt cay Capsicum frutescens L.; ớt ngọt Capsicum annuum L.; thuốc lỏ Nicotiana benthamiana Domin, N. tabacum cv. Samsun,
N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi - nc, Petunia hybrida; thuốc lỏ trồng Nicotiana tabacum cv. CB326; thuốc lào Nicotiana glutinosa; cà chua Lycopersicon esculentum Mill.; thự lự cạnh Physalis angulata L.; lu lu ủực Solanum nigrum L.; cà tớm Solanum melongena cv. Mustang; cà phỏo Solanum melongena var. depressum Bailey; cà gai Datura sp.; cà ủộc dược Datura stramonium L.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
3.5.2.3 Cỏch lõy nhiễm lờn cõy thớ nghiệm
Khi cõy lõy nhiễm cú số lỏ thật ủạt yờu cầu thớ nghiệm thỡ tiến hành làm thớ nghiệm lõy nhiễm nhõn tạo lờn cõy lõy nhiễm bằng phương phỏp tiếp xỳc cơ học và cụn trựng mụi giới. Tiến hành làm thớ nghiệm vào buổi chiều. Cõy chỉ thị ủược ủể trong búng tối trước một ngày thớ nghiệm.
Nghiền mẫu lỏ bệnh trong dung dịch ủệm 0,01M Phosphate, pH 7, với tỷ lệ 1 g lỏ bệnh/5 ml dung dịch ủệm bằng chày cối sứ ủó ủược khử trựng. Dung dịch 0,01M Phosphate, pH 7,0 ủược ủể lạnh trước khi làm thớ nghiệm. Lọc phần dịch nghiền qua vải lọc ủể thu lấy dịch chiết và loại bỏ bó. Sau ủú, thờm vào bột carborandum 600 Mesh vào hỗn hợp dịch ủó ủược nghiền. Cối sứ chứa hỗn hợp dung dịch trờn ủược ủặt vào trong hộp ủỏ lạnh.
ðeo găng tay cao su và dựng ngún trỏ nhỳng vào dịch hỗn hợp cú chứa virus rồi sỏt nhẹ lờn lỏ cõy theo chiều từ cuống lỏ ủến chúp lỏ. Sau thời gian lõy nhiễm từ 30 phỳt, dựng bỡnh xịt cú chứa nước cất rửa dịch chiết và bột carborandum 600 Mesh bỏm trờn bề mặt lỏ ủể thuận lợi cho việc quan sỏt triệu chứng bệnh sau này ủược rừ ràng. Cõy thớ nghiệm ủặt trong nhà lưới chống cụn trựng, thực hiện chăm súc cõy và theo dừi triệu chứng biểu hiện bệnh của cõy lõy nhiễm. Ghi chộp, quan sỏt mụ tả và ủỏnh giỏ kết quả cỏc chỉ tiờu theo dừi. Tiến hành theo dừi triệu chứng bệnh bằng việc hàng ngày quan sỏt cỏc biến ủổi trờn cõy, ủặc ủiểm hỡnh dạng và kớch thước vết bệnh.
3.5.3 Phương phỏp xỏc ủịnh sự lan truyền của virus khảm ủốm gõn lỏ ớt
(ChiVMoV) bằng cụn trựng mụi giới
3.5.3.1 Phương phỏp nuụi rệp
Phương phỏp xỏc ủịnh sự lan truyền của virus khảm ủốm gõn lỏ ớt (ChiVMoV) bằng cụn trựng mụi giới (vector) dựa theo tài liệu của Green (1991)[37], Nguyễn Thị Kim Oanh (1996)[15] và Bộ mụn Cụn trựng (2004)[1].
* Vector dựng trong thớ nghiệm:
Rệp bụng Aphis gossypii Glover thu bắt trờn cõy ủơn buốt, khoai nước và nuụi rệp trờn cõy ớt, thự lự cạnh.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………26
* Phương phỏp tiến hành: Rệp non tuổi 1 ủến trưởng thành ủược thu thập trờn cõy khụng triệu chứng ngoài ủồng ruộng và ủược nuụi trờn cõy ký chủưa thớch, khụng cú triệu chứng bệnh.
Cõy lõy rệp ủược giữ trong ủiều kiện cỏch ly.
Dựng bỳt lụng ủó ủược thấm nước ủể bắt rệp. Cụng việc này tiến hành cẩn thận, từ từ, ủể rệp kịp rỳt ngũi ra khỏi cõy, ủồng thời trỏnh làm nỏt mẫu. Thu bắt rệp tuổi 2 - 3 ủến trưởng thành (loại hỡnh khụng cú cỏnh). Thả rệp vào ủĩa petri và ủể ủúi trong thời gian 60 phỳt, khụng bổ sung thức ăn cho rệp. Sau ủú, bắt rệp thả vào lỏ nhiễm ChiVMoV ủược ủặt trờn giấy thấm chứa trong ủĩa petri cú ủỏnh ký hiệu và số thứ tự. Lỏ ủược cắt và ủặt nằm gọn trong
ủĩa petri, trỏnh rệp bũ ra khỏi lỏ. ðể rệp chớch hỳt trong thời gian từ 2 - 3 phỳt rồi chuyển rệp lờn cõy thớ nghiệm.
ðể rệp chớch hỳt lờn cõy thớ nghiệm trong thời gian 60 phỳt rồi sau ủú phun thuốc Actara 25WG ủể diệt trừ rệp. Cõy thớ nghiệm ủược ủặt trong lồng lưới cỏch ly cụn trựng và ủể lồng vào trong nhà lưới.
3.5.3.2 Phương phỏp lõy nhiễm rệp muội với cỏc cõy thớ nghiệm khỏc nhau
Cỏc cõy thớ nghiệm: thuốc lỏ Nicotiana tabacum cv. Samsun,
N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi-nc, ớt cay Capsicum frutescens cv. Red Chilli và rau muối Chenopodium amaranticolor.
Mỗi cụng thức dựng 5 cõy và thả 10 rệp/cõy và cú cụng thức ủối chứng. Phương phỏp tiến hành như mục 3.5.3.1.
Cỏc chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục.