3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.5.8 Phương phỏp xỏc ủịnh virus bằng phương phỏp huyết thanh
Cỏc phương phỏp huyết thanh dựa theo tài liệu mụ tả của Green (1991)[37] và Vũ Triệu Mõn (2003)[13].
Sử dụng phương phỏp ELISA giỏn tiếp (Indirect - ELISA) ủể chẩn
ủoỏn một số bệnh virus thực vật. Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Cố ủịnh dịch cõy cần kiểm tra vào bản, cần mỗi mẫu 0,2 g lỏ cho chày cối sứ ủó ủược hấp khử trựng nghiền trong dung dịch Carbonate 0,05M pH 9,6 với tỷ lệ lỏ/dung dịch ủệm (g/ml) 1/10 - 1/50. Hỳt lấy dịch trờn tủa, nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 àl/giếng. Sau ủú ủể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua một ủờm ở nhiệt ủộ 40C.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu cõy khoẻ nghiền trong dung dịch ủệm pha huyết thanh (PBST-PVP-Ovalbumin) theo tỷ lệ 1/20 (g/ml). Cho khỏng huyết thanh vào dịch cõy khoẻ theo nồng ủộủó pha loóng tuỳ từng loại khỏng huyết thanh khuấy ủều và ủể 45 phỳt trong ủiều kiện 370C.
Bước 3: Rửa bản ELISA với ủệm PBS - Tween 1X 3 lần và 2 lần bằng nước cất. Mỗi lần cỏch nhau 3 phỳt.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………30
Bước 4: Cốủịnh khỏng huyết thanh vào bản ELISA, nhỏ vào mỗi giếng 100 àl khỏng huyết thanh ủó pha loóng trong dịch cõy khoẻ. Sau ủú cho bản ELISA vào trong hộp ẩm và ủểởủiều kiện nhiệt ủộ 370C trong thời gian 1h30 phỳt.
Bước 5: Rửa bản ELISA nhưở bước 3.
Bước 6: Cố ủịnh khỏng huyết thanh của khỏng nguyờn IgG thỏ
(conjugate AP-alkaline phosphate) với ủệm PBST-PVP-Ovalbumin với ủộ
hoà loóng 1/2000. Nhỏ vào mỗi giếng 100 àl. ðặt bản ELISA vào hộp ẩm và
ủểở nhiệt ủộ 370C trong 1h30 phỳt.
Bước 7: Rửa bản ELISA như bước 3.
Bước 8: Cốủịnh chất nền và ủỏnh giỏ kết quả:
- Pha 0,5 mg NPP (p - nitrophenyl phosphate)/1ml ủệm substrate rồi hoà tan bằng mỏy khuấy từ.
- Sau ủú nhỏ dung dịch trờn vào bản ELISA, nhỏ 100 àl/giếng.
ðưa bản ELISA vào hộp ẩm và ủể trong búng tối ở ủiều kiện nhiệt ủộ
phũng thớ nghiệm với thời gian từ 60 - 90 phỳt. Bước 9: ðọc kết quả:
Cỏc giếng cú màu vàng là cỏc giếng cú phản ứng (+) tức là cõy nhiễm bệnh. Giếng khụng màu là cõy khụng bị nhiễm bệnh. ðọc kết quả tiếp bằng cỏch ủưa vào mỏy ủọc ELISA ở bước súng 405 nm. Dừng phản ứng bằng NaOH 3M với lượng 50 àl/giếng.