3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.5.10Phương phỏp làm sạch ChiVMo
Phương phỏp làm sạch ChiVMoV dựa theo tài liệu của Moghal (1976). Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Nghiền 100 g lỏ tươi giống thuốc lỏ Nicotiana tabacum cv. Samsun nhiễm ChiVMoV trong dung dịch ủệm 0,2M Na-Borate cú chứa 0,1M EDTA, pH 8,0 theo tỷ lệ 1 g lỏ bệnh/3 ml dung dịch ủệm. Bổ sung 20% Chloroform ủể lạnh. Nghiền hỗn hợp bằng mỏy nghiền. Phần dịch nghiền ủược lọc qua vải lọc. Lấy phần dịch chiết, loại bỏ cặn.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………33
Bước 2: Ly tõm phần dịch chiết trong tube nhựa lớn với tốc ủộ
10.000 g (g: lực ly tõm) trong thời gian 10 phỳt ở ủiều kiện 40C bằng mỏy ly tõm Beckman Allegra 64R. Loại bỏ cặn. Lấy dịch trờn kết tủa.
Bước 3: Bổ sung 3% PEG (polyethylen glycol) cú trọng lượng phõn tử
6.000 và 2% NaCl vào dịch nước trong ủó thu ủược ở trờn. Khuấy ủều bằng mỏy khuấy từ trong thời gian 30 phỳt ởủiều kiện 40C.
Bước 4: Ly tõm phần dịch chiết trong tube nhựa lớn với tốc ủộ
10.000 g trong thời gian 20 phỳt ở ủiều kiện 40C bằng mỏy ly tõm Beckman Allegra 64R. Gạn lọc bỏ phần nước nổi. Lấy phần cặn.
Bước 5: Hoà cặn trong 15 ml dung dịch ủệm 0,1M Borate, pH 8,0. Khuấy ủều ởủiều kiện 40C và ủể qua ủờm.
Bước 6: Ly tõm phần dịch chiết trong tube nhựa lớn với tốc ủộ 10.000 g
trong thời gian 10 phỳt ở ủiều kiện 40C. Gạn lấy phần nước nổi. Loại bỏ phần cặn.
Bước 7: Ly tõm dịch chiết với tốc ủộ cao 78.000 g trong thời gian 3h
ở ủiều kiện 40C bằng mỏy siờu ly tõm Beckman Coulter 90K, Type 90Ti. Gạn lọc bỏ phần nước nổi. Lấy phần cặn.
Bước 8: Hoà cặn bằng 2 ml dung dịch ủệm 0,01M Borate, pH 8,0. Khuấy ủều bằng mỏy khuấy từ trong thời gian 3h ởủiều kiện 40C.
Bước 9: Ly tõm phần dịch chiết trong ống nghiệm với tốc ủộ 10.000 g
trong thời gian 10 phỳt ởủiều kiện 40C. Gạn lấy phần nước nổi. Loại bỏ phần cặn. Bước 10: Phần nổi cú chứa dịch ChiVMoV ủó ủược làm bỏn sạch. Tạo gradient trong ống nghiệm với nồng ủộ dung dịch ủường sucrose 10 - 40% cú bổ sung dung dịch ủệm 0,01M Borate, pH 8,0. Ly tõm ống nghiệm bằng rotor SW 41Ti với tốc ủộ 64.047 g trong thời gian 3h ởủiều kiện 40C.
Cất giữ, bảo quản dịch virus (ChiVMoV) ủó ủược làm sạch ở ủiều kiện nhiệt ủộ – 200C.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………34