3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.5.9 Phương phỏp xỏc ủịnh virus bằng RT-PCR
Phương phỏp xỏc ủịnh virus bằng RT-PCR dựa theo tài liệu mụ tả của Wang và CS (2003).
3.5.9.1 Tỏch chiết RNA tổng số từ mụ lỏ
Trước khi chiết, ủ ủệm CTAB (cetyl trimethyl amonium bromide) ủó
ủược bổ sung β-ME (β-mercapto ethanol) theo tỷ lệ 10 àl/1 ml ủệm trong bể nhiệt ởủiều kiện nhiệt ủộ 600C trong thời gian 30 phỳt.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………31
Cỏc bước tiến hành:
Bước 1: Lấy 0,05 g lỏ tươi (hoặc 0,01 g lỏ sấy khụ) nhiễm bệnh nghiền trong 0,5 ml dung dịch ủệm CTAB bằng chày cối sứ ủó ủược hấp khử trựng. Sau ủú, cho dịch nghiền vào tube và ủ trong bể nhiệt ở ủiều kiện nhiệt ủộ 600C trong thời gian 10 phỳt. Ly tõm tube trong thời gian 5 phỳt. Thu lấy dịch trờn tủa và loại bỏ cặn. ðể tube ởủiều kiện nhiệt ủộ phũng trong thời gian 10 phỳt.
Bước 2: Bổ sung Chloroform/Isoamyl (tỷ lệ 24:1) vào tube với thể tớch tương ủương rồi trộn và lắc ủều. Ly tõm trong thời gian 5 phỳt. Thu lấy dịch trờn tủa và loại bỏ cặn.
Bước 3: Chiết lại lần thứ 2 bằng Chloroform/Isoamyl giống như bước 2. Bước 4: Bổ sung 10M LiCl (lithium chloride) vào dịch trong tube vừa thu ủược theo tỷ lệ 1: 4. Sau ủú ủể trong tủ lạnh sõu – 200C, thời gian 15 phỳt. Ly tõm dịch chiết trong tube với thời gian 15 phỳt. Loại bỏ nước trong và thu cặn cú chứa RNA, spin tube.
Bước 5: Rửa cặn cú chứa RNA hai lần bằng cồn 700, spin tube. ðể khụ trong ủiều kiện nhiệt ủộ phũng trong thời gian 30 phỳt.
Bước 6: Hoà tan cặn cú chứa RNA bằng 50 àl nước cất vụ trựng, spin tube. Bảo quản mẫu ởủiều kiện – 800C.
3.5.9.2 Chạy RT-PCR và kiểm tra kết quả phản ứng
Cặp mồi ủặc hiệu cho ChiVMoV ủó ủược thiết kế trờn vựng gen mó hoỏ vỏ protein (CP) ký hiệu là ChiVMoV-F và ChiVMoV-R.
Thành phần mồi phản ứng RT-PCR chứa trong tube 0,5 ml, dựng Superscript III One-Step RT-PCR Kit của hóng Invitrogen.
Thành phần Thể tớch (àl) Nước cất vụ trựng : 20,75 2 x Reaction mix (ủệm RT-PCR +dNTPs) : 2,5 Mồi xuụi (ChiVMoV-F) : 0,5 Mồi ngược (ChiVMoV-R) : 0,5 Enzyme mix : 0,25
RNA tổng số (ủó tỏch chiết ủược) : 1,0 Tổng thể tớch phản ứng : 25,0 àl
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………32
* Chu trỡnh chạy RT-PCR trong mỏy PCR:
420C trong thời gian 30 phỳt x 1 lần (chu kỳ); 940C trong thời gian 4 phỳt x 1 lần; 940C trong thời gian 30 phỳt x 35 lần; 400C trong thời gian 30 phỳt x 35 lần; 680C trong thời gian 1 phỳt x 35 lần; 680C trong thời gian 5 giờ x 1 lần.
* Chạy ủiện di sản phẩm PCR và xem kết quả phản ứng:
Pha agarose 1% trong ủệm TAE 1X (tris base - acetic acid - ethylene diamine tetraacetate) ủun sụi ủể dung dịch ủồng nhất trong lũ vi súng. Sau ủú, bổ sung ethidium bromide với lượng 2 àl/100 ml dung dịch agarose 1% .
Dỏn băng dớnh xung quanh khuụn, ủặt lược tạo lỗ khuụn. Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 50 - 600C thỡ ủổ vào khuụn. ðể khuụn gel
ở nhiệt ủộ phũng trong thời gian 45 phỳt. Sau ủú, tiến hành rỳt lược, bỏ băng dớnh ở xung quanh khuụn gel. ðặt cả khay khuụn gel vào bể ủiện di, ủổ dung dịch ủệm TAE 1X phủ ngập khuụn gel.
Dựng pipột nhỏ mẫu cần kiểm tra (cú chứa sản phẩm RT-PCR, nước cất vụ trựng và loading dye) vào cỏc giếng của khuụn gel. Nhỏ 1 mẫu/1 giếng của khuụn gel và nhỏ một giếng marker (GeneRuler thang DNA kớch thước 1,0 kb của hóng Fermentas) làm chuẩn.
Chạy ủiện di ở hiệu ủiện thế 100 Vols trong thời gian 30 phỳt. Sau 30 phỳt, tắt mỏy ủiện di, ủặt bản agarose lờn mỏy phỏt tia cực tớm, quan sỏt vệt RNA.