3. ðỐ IT ƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG
3.5.11 Phương phỏp sản xuất và thử nghiệm khỏng huyết thanh ChiVMo
3.5.11.1 Phương sản xuất khỏng huyết thanh ChiVMoV
Phương sản xuất khỏng huyết thanh ChiVMoV dựa theo tài liệu mụ tả
của Im và Green (1988)[49], Green (1991)[37].
ðối tượng ủược chọn ủể tiờm là thỏủó trưởng thành cú khối lượng trờn 2 kg, khoẻ mạnh, khụng bệnh. ðợt tiờm thứ nhất dịch ChiVMoV ủược hoà lẫn với Freund’s complete adjuvant theo tỷ lệ 1/1. Cỏc ủợt tiờm tiếp theo dịch ChiVMoV ủược hoà lẫn với Freund’s incomplete adjuvant theo tỷ lệ 1/1. Hỗn hợp này ủược tiờm vào bắp ủựi thỏ.
Thời gian tiờm ủược lặp lại 4 lần, mỗi lần cỏch nhau 7 ngày. Tiến hành lấy mỏu sau 2, 3 và 4 tuần tiờm, mỗi lần lấy 0,5 ml mỏu thỏủể kiểm tra và lấy hoàn toàn mỏu thỏ sau khi ngừng tiờm 7 ngày. Sau khi thử mỏu thỏ thấy cú hiệu quả của khỏng huyết thanh (KHT) thỡ tiến hành giết thỏ ủể thu KHT. Mỏu thu ủược từ thỏ ly tõm với tốc ủộ 5.000 g trong thời gian 10 phỳt ở ủiều kiện 40C, thu huyết thanh nổi lờn trờn. Tiếp tục làm trong KHT bằng cỏch ly tõm với tốc ủộ 5.000 g trong thời gian 5 phỳt ởủiều kiện 40C.
Khỏng huyết thanh ủược bổ sung glycerol với tỷ lệ 1/1 và thờm NaN3
0,05% rồi bảo quản ở tủ lạnh sõu – 200C.
3.5.11.2 ðiều kiện thực hiện phản ứng với khỏng huyết thanh ChiVMoV
Quỏ trỡnh làm sạch virus ủể tiờm vào thỏ vẫn cũn lẫn protein của lỏ cõy. Vỡ vậy, trong khỏng huyết thanh ủó thu ủược cũn lẫn khỏng thể của protein thuốc lỏ, do ủú cần phải dựng chớnh protein của thuốc lỏ ủể hấp thụ chộo khỏng thểủú ra.
Phương phỏp nghiền trực tiếp lỏ thuốc lỏ ủể lấy protein dựng cho hấp thụ chộo: Chuẩn bị mẫu cõy khỏe nghiền trong dung dịch pha huyết thanh PBST-PVP-Ovalbumin theo tỷ lệ 1/10 và 1/20. Lọc qua vải lọc ta thu ủược dịch cõy khỏe theo nồng ủộ ủó pha loóng, khuấy ủều và ủ trong 45 phỳt ở
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………35
Thớ nghiệm so sỏnh cú hấp phụ chộo dịch cõy khoẻ và khụng hấp phụ
chộo dịch cõy khoẻ với khỏng huyết thanh ChiVMoV, tiến hành thử trờn 6 mẫu bệnh, 3 mẫu khỏe và 3 mẫu ủệm PBST-PVP-Ovalbumin.
Thớ nghiệm so sỏnh hấp phụ chộo dịch cõy khoẻ cú ly tõm và hấp phụ
chộo dịch cõy khoẻ khụng ly tõm với khỏng huyết thanh ChiVMoV, tiến hành thử trờn 6 mẫu bệnh, 3 mẫu khỏe và 3 mẫu ủệm PBST-PVP-Ovalbumin.
3.5.11.3 Thử nghiệm phản ứng chộo của khỏng huyết thanh ChiVMoV
Dựng khỏng huyết thanh ChiVMoV ủể thử phản ứng chộo với virus Y khoai tõy (potato virus Y - PVY), virus khảm lỏ mớa (sugarcane mosaic virus - ScMV), virus khảm ủốm hỡnh nhẫn ủu ủủ (papaya ringspot virus - PRSV) và virus khảm thuốc lỏ (tobacco mosaic virus - TMV). Cỏc mẫu virus thử
nghiệm dựng trong phản ứng chộo ủó ủược kiểm tra bằng phương phỏp ELISA giỏn tiếp và ủều là những mẫu bệnh ủiển hỡnh của từng loại virus ủú. Mỗi loài virus tiến hành thử trờn 6 mẫu bệnh, 3 mẫu khỏe và 3 mẫu ủệm PBST-PVP-Ovalbumin với khỏng huyết thanh ChiVMoV.
3.5.12.4 Phương phỏp thử nghiệm khỏng huyết thanh ChiVMoV ủó sản xuất
Với khỏng huyết thanh chưa kết tủa với AS (amonium sulfate) 4M cú phương phỏp thử nghiệm sau:
Dựng protein nghiền trực tiếp từ lỏ cõy ủể hấp thụ chộo với khỏng huyết thanh ủó sản xuất.
Tiến hành thử nghiệm trờn 6 mẫu bệnh, 3 mẫu khỏe và 3 mẫu ủệm PBST-PVP-Ovalbumin. Pha khỏng huyết thanh ChiVMoV với dịch cõy khỏe theo tỷ lệ 1/100, 1/500, 1/1000 và 1/1500. Sau ủú dựng cỏc nồng ủộ này
ủể thử, rỳt ra kết luận nồng ủộ tối ưu.
Thử nghiệm ngưỡng pha loóng dịch cõy cần kiểm tra với khỏng huyết thanh ChiVMoV ủó tạo ủược theo tỷ lệ 1/10, 1/20 và 1/50. Thử nghiệm trờn 6 mẫu bệnh, 3 mẫu khỏe và 3 mẫu ủệm PBST-PVP-Ovalbumin.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………36