Lấy phân của những chó nghi mắc Parvovirus. Dùng test thử CPV
(Canine Parvovirus One - step Test Kit) ựể chẩn ựoán bệnh.
a. Nguyên lý
Test này dựa vào nguyên lý của phản ứng ựể phát hiện kháng nguyên (KN) của Parvovirus trên chó từ các mẫu xét nghiệm phân. Hai kháng thể
(KT) ựơn dòng trong thiết bị kết hợp với các ựiểm quyết ựịnh kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn ựoán. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trắ ựệm celluloze của thiết bị, các kháng nguyên của Parvovirus sẽ di chuyển và kết hợp ELISA với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể ựơn dòng kháng virus, ựể tạo thành phức hợp ỘKT-KNỢ. Sau ựó, phức hợp này kết hợp với kháng thể ựơn dòng kháng Parvovirus khác trong màng nitơ-cellulose của thiết bị, ựể tạo thành phức hợp kẹp hoàn chỉnh ỔKT-KN-KTỖ. Kết quả xét nghiệm có thể ựược biểu lộ qua sự xuất hiện các vạch C và T do thiết bị sử dụng "phép sắc ký miễn dịch".
b. đặc tắnh
- Xét nghiệm nhanh có thể phát hiện kháng nguyên của Parvovirus trên chó. - Kết quả xét nghiệm nhanh trong vòng 5-10 phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 - Không cần sử dụng thiết bị ựắt tiền.
- Dễ dự trữ và bảo quản.
- Các nguyên liệu xét nghiệm có ựộ tinh khiết và chất lượng cao, làm tăng ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu của thiết bị.
c. Vật liệu
10 test /hộp
- Thiết bị xét nghiệm 10 ựơn vị - Chất pha loãng (dung dịch ựệm) 1ml x 10 ựơn vị
- Ống nhỏ giọt 10 ựơn vị - Que lấy bệnh phẩm 10 ựơn vị
d. Thành phần
Thiết bị xét nghiệm có ựánh dấu vùng S (vị trắ nhỏ giọt), vạch kết quả xét nghiệm T và vạch chứng C. Thiết bị này gồm các thành phần như chất ựệm mẫu, chất ựệm, màng nitơ-cellulose (giấy xét nghiệm) và chất ựệm hấp thu.
e. Tác dụng
Phát hiện kháng nguyên Parvovirus trên chó từ các mẫu phân.
f. Cách sử dụng
- Mẫu xét nghiệm: Phân của chó nghi mắc Parvovirus. - Cách bảo quản mẫu bệnh phẩm:
+ Bảo quản mẫu ở 2 Ờ 80C trong vòng 24 giờ. + Giữ mẫu ở nhiệt ựộ 22 Ờ 250 C trước khi sử dụng. - Thao tác xét nghiệm:
+ Lấy mẫu phân bằng một que lấy bệnh phẩm và ựưa que vào lọ chứa 1ml chất pha loãng.
+ Khuấy ựộng xoay tròn que trong chất pha loãng. + Lấy mẫu phân pha loãng với 1 ống nhỏ giọt.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 31 + đọc kết quả xét nghiệm trong vòng 5 Ờ 10 phút. Kết quả âm tắnh cần xem xét sau 10 phút.
g. Giải thắch kết quả xét nghiệm
Vệt màu ựỏ tắa sẽ xuất hiện trên vạch chứng C không liên quan ựến kết quả xét nghiệm. Sự hiện diện của vệt khác trên vạch mẫu T xác ựịnh kết quả xét nghiệm.
Vạch chứng C: Vạch này sẽ luôn luôn xuất hiện bất kể có sự hiện diện hay không của kháng nguyên Parvovirus. Nếu vạch này không xuất hiện, test xem như không có giá trị, có thể do chất pha loãng không tinh khiết và thiếu mẫu xét nghiệm. Cần làm lại với chất pha loãng mới.
Vạch mẫu T: xác ựịnh sự hiện diện của kháng nguyên Parvovirus - Âm tắnh: Chỉ xuất hiện vạch chứng C.
- Dương tắnh: Xuất hiện cả vạch mẫu T và vạch chứng C. - Làm lại xét nghiệm khi:
+ Cả hai vạch mẫu T và vạch chứng C ựều không xuất hiện. + Chỉ có vạch mẫu T xuất hiện
Ảnh 3.1. Tets thử CPV (Canine Parvovirus One Ờ step Test Kit ) 3.3.2. Phương pháp theo dõi các triệu chứng lâm sàng
Những chó có kết quả kiểm tra bằng test CPV dương tắnh. Dùng phương pháp quan sát ựể theo dõi các triệu chứng lâm sàng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 đồng thời, theo dõi các chỉ tiêu lâm sàng sau:
- Thân nhiệt (oC): dùng nhiệt kế ựiện tử ựo nhiệt ựộ trực tràng vào buổi sáng hoặc trước khi ựiều trị.
- Tần số hô hấp (lần/phút): dùng ống nghe vùng phổi trong một phút, nghe lại hai lần và lấy kết quả trung bình của ba lần nghe.
- Tần số tim mạch (lần/phút): dùng ống nghe nghe vùng tim bên trái ựếm số lần tim mạch trong một phút, nghe lại hai lần và lấy kết quả trung bình của ba lần nghe.
3.3.3. Phương pháp mổ khám
Mổ khám chó mắc bệnh bị chết ựể quan sát tổn thương ựại thể. Bao gồm các bước sau:
- Bước 1: đặt chó nằm trên bàn mổ hoặc tấm ván hay túi nilon ựã chuẩn bị trước, dùng dao cắt da và các cơ trong nách tới khớp xương bả vai và kéo dài ựến cằm cả hai bên, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho chó nằm tư thế nằm ngửa.
- Bước 2: Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng ựể bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
- Bước 3: Quan sát dịch chứa trong xoang ngực và xoang bụng, kiểm tra những biến ựổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kắch thước, hình dáng. - Bước 4: Cắt tách lưỡi, thực quản, khắ quản, phổi, cuối cùng cắt ựứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành. Kéo toàn bộ hệ thống dạ dày ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn các tổ chức khác. Lấy các tổ chức trong cổ, ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
- Bước 5: Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 - Bước 6: Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khắ quản, phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và ựộ ựàn hồi.
- Bước 7: Rạch kiểm tra chất chứa bên trong thực quản, gạt bỏ chất chứa kiểm tra niêm mạc.
- Bước 8: Lấy gan, mật, lá lách ra ựể kiểm tra về màu sắc, kắch thước, ựộ cứng mềm, ký sinh trùng, các ổ viêm, hoại tử, ổ áp xe. Rạch bổ gan và lách kiểm tra có bị sưng, tách túi mật kiểm tra niêm mạc.
- Bước 9: Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ ựôi kiểm tra bên trong thận, kiểm tra bóng ựái.
- Bước 10: Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba trong cơ thể về màu sắc, kắch thước và ựộ ựàn hồi, bổ ựôi kiểm tra bên trong và có biểu hiện sưng hay không. - Bước 11: Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hóa theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn loại bỏ chất chứa quan sát bề mặt niêm mạc ựặc biệt chú ý tới: chất chứa, dịch, màu sắc, ựiểm hoại tử, xuất huyết.
- Bước 12: Lấy các cơ quan, tổ chức làm tiêu bản vi thể.
3.3.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Chó bị bệnh do Parvovirus sau khi quan sát tổn thương ựại thể, tiến hành lấy bệnh phẩm ngâm trong dung dịch formol 10% ựể tiến hành làm tiêu bản vi thể, tiêu bản hóa mô miễn dịch. Chúng tôi lấy bệnh phẩm gồm: ruột non, ruột già, dạ dày, hạch màng treo ruột, tim, gan, lách, phổi.
Mỗi con chó bệnh chúng tôi tiến hành lấy trên mỗi cơ quan có tổn thương 3 miếng bệnh phẩm ở 3 vị trắ khác nhau và ựúc thành 3 block. Mỗi block ựược chúng tôi cắt và làm tiêu bản rồi chọn 3 tiêu bản ựẹp nhất quan sát các tổn thương vi thể, nếu tế bào có tổn thương ựược ký hiệu là +.
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm ựúc bằng Parafin, cắt dán tiêu bản và nhuộm Hematoxylin Ờ Eosin. Phương pháp bao gồm các bước sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 ựựng hóa chất, phiến kắnh, máy ựúc block, khuôn ựúc, tủ ấm 370C, máy cắt microtom, nước ấm 48 -520C, Xylen, Paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, EosinẦ
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là lách, hạch màng treo ruột, ruột, dạ dày, gan thận, não, phổi.
Cố ựịnh bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (thể tắch Formol gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong Formol).
Vùi bệnh phẩm: bao gồm các bước sau
+ Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 -5 mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựa. đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ựể rửa sạch Formol.
+ Chạy mẫu: ựưa mẫu vào hệ thống các bình ựựng hóa chất trong 54h (bảng 3.1). Lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
Bảng 3.1. Quy trình chuyển ựúc mẫu
Bình Hóa chất Thời gian (h)
1 Cồn 700C 3:00 2 Cồn 800C 3:00 3 Cồn 960C 3:00 4 Cồn 1000C 12:00 5 Xylen 3:00 6 Xylen 3:00 7 Xylen 3:00 8 Paraffin 6:00 9 Paraffin 6:00 10 Paraffin 12:00
+ đúc block: ựặt miếng bệnh phẩm vào chắnh giữa khuôn block, ựổ nhanh Paraffin lỏng vào khuôn block. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội ựến khi block ựông cứng, ựặc chắc là ựược.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 5 ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức. Sau ựó, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt ựều, lấy phiến kắnh hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 Ờ 520C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. để tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin Ờ Eosin.
Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau
+ Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút Xylen III : 10 phút
+ Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc Cồn 1000C : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950C : 1 lần Cồn 700C : 1 lần Cồn 500C : 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5 Ờ 10 phút.
+ Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản. để khoảng 3 Ờ 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu ựậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960C + HCl 1%) trong 30 giây. + Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 Ờ 5 phút, sau ựó rửa nước chảy 5 Ờ 10 phút cho hết Eosin thừa.
+ Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt ựối, mỗi lọ 1 phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 + Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
+ đánh giá kết quả: ựem soi lên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
3.3.5. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Chúng tôi tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch với các lát cắt ở các mô khác nhau của 5 chó mắc bệnh. Khi có mặt của virus trong tổ chức ựem làm hóa mô miễn dịch sẽ cho kết quả dương tắnh với sự xuất hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (khi dùng DAB). Virus tập trung càng nhiều thì sự bắt màu càng rõ, mức dương tắnh càng cao. Với mỗi lô nhuộm hóa miễn dịch ựối chứng âm là lát cắt của chó khỏe.
Nguyên lý: Phương pháp hóa mô miễn dịch sử dụng phản ứng kháng nguyên Ờ kháng thể ựặc hiệu áp dụng cho các mảnh cắt ựã chuyển ựúc Paraffin. Các mảnh cắt sau khi ựã khử sạch Paraffin ựược phủ kháng thể lên bề mặt. Nếu trong mô bệnh phẩm có kháng nguyên tương ứng với kháng thể, phức hợp kháng nguyên Ờ kháng thể sẽ ựược hình thành. Phức hợp này ựược nhận biết nhờ hệ thống khuếch ựại tắn hiệu bao gồm kháng thể bắc cầu (kháng kháng thể) và hóa chất nhuộm màu DAB (3,39 diaminobenzidine tetraclorua). Các bước tiến hành
- Hóa chất dụng cụ: tủ ấm 370C, pipeteman, dung dịch PBS (Phosphate buffer saline), dung dịch Tris 0,05M, H2O2 30%, dịch DAB (pha dung dịch DAB: 0,23g DAB + 17ộl H2O2 30% +50ml dung dịch Tris 0,05M). Phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm ựúc bằng Paraffin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 Bước 1: làm sạch tiêu bản
Khử Paraffin, khử Xylen, khử cồn giống như phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: hoạt hóa enzyme
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút. Bước 3: khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1 H2O2 30% : 9 Methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: gắn kháng thể
Nhỏ 80ộl kháng thể chống Parvovirus lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua ựêm. Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: gắn kháng kháng thể
Nhỏ 80ộl kháng kháng thể lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h. Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 6: cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 Ờ 8 phút.
Kiểm tra tiêu bản dưới kắnh hiển vi thường. Nếu thấy bắt màu thì dừng phản ứng bằng nước sạch. Nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ựến khi xuất hiện màu.
Bước 7: nhuộm nhân tế bào
Nhuộm bằng Hematoxylin (30s), làm sạch, gắn lamen và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và trên phần mềm Excel 2007. Số trung bình: n X X n 1 i i ∑ =
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
X: giá trị trung bình n: dung lượng mẫu Phương sai: 1 n ) X (X δ 2 i 2 − − = ∑ Với n < 30 n ) X (X δ 2 i 2 ∑ − = Với n ≥ 30 độ lệch chuẩn: ( ) 1 − − Χ = ∑ n X i δ Với n < 30 ( ) n X Xi − ∑ = δ Với n ≥ 30 Sai số chuẩn: 1 n δ mx − ổ = Với n < 30 n δ mx =ổ Với n ≥ 30
Dùng test t so sánh các chỉ tiêu nghiên cứu giữa chó mắc bệnh do
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CỦA CHÓ MẮC PARVOVIRUS
4.1.1. Xác ựịnh chó mắc Parvovirus
Trong quá trình thực hiện ựề tài, có 335 trường hợp ựược chẩn ựoán nghi mắc bệnh do Parvovirus. để xác ựịnh bệnh một cách chắnh xác, chúng tôi sử dụng test CPV trên 90 con chó với những triệu chứng ựiển hình của bệnh và lấy mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả ựược thể hiện qua bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả ghi nhận các ca thử test CPV (n = 90)
Tuổi Test Giống Giới tắnh < 6 tuần tuổi 6 tuần - 3 tháng tuổi 4 - 6 tháng tuổi > 6 tháng tuổi (+) (-) Tổng cộng đực 2 (+) 4 (+) 2 (-) 4 (+) 1 (-) 10 3 13 Nội Cái 5 (+) 1 (-)