Chúng tôi tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch với các lát cắt ở các mô khác nhau của 5 chó mắc bệnh. Khi có mặt của virus trong tổ chức ựem làm hóa mô miễn dịch sẽ cho kết quả dương tắnh với sự xuất hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (khi dùng DAB). Virus tập trung càng nhiều thì sự bắt màu càng rõ, mức dương tắnh càng cao. Với mỗi lô nhuộm hóa miễn dịch ựối chứng âm là lát cắt của chó khỏe.
Nguyên lý: Phương pháp hóa mô miễn dịch sử dụng phản ứng kháng nguyên Ờ kháng thể ựặc hiệu áp dụng cho các mảnh cắt ựã chuyển ựúc Paraffin. Các mảnh cắt sau khi ựã khử sạch Paraffin ựược phủ kháng thể lên bề mặt. Nếu trong mô bệnh phẩm có kháng nguyên tương ứng với kháng thể, phức hợp kháng nguyên Ờ kháng thể sẽ ựược hình thành. Phức hợp này ựược nhận biết nhờ hệ thống khuếch ựại tắn hiệu bao gồm kháng thể bắc cầu (kháng kháng thể) và hóa chất nhuộm màu DAB (3,39 diaminobenzidine tetraclorua). Các bước tiến hành
- Hóa chất dụng cụ: tủ ấm 370C, pipeteman, dung dịch PBS (Phosphate buffer saline), dung dịch Tris 0,05M, H2O2 30%, dịch DAB (pha dung dịch DAB: 0,23g DAB + 17ộl H2O2 30% +50ml dung dịch Tris 0,05M). Phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm ựúc bằng Paraffin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 Bước 1: làm sạch tiêu bản
Khử Paraffin, khử Xylen, khử cồn giống như phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: hoạt hóa enzyme
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút. Bước 3: khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1 H2O2 30% : 9 Methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: gắn kháng thể
Nhỏ 80ộl kháng thể chống Parvovirus lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua ựêm. Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: gắn kháng kháng thể
Nhỏ 80ộl kháng kháng thể lên tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h. Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần)
Bước 6: cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 Ờ 8 phút.
Kiểm tra tiêu bản dưới kắnh hiển vi thường. Nếu thấy bắt màu thì dừng phản ứng bằng nước sạch. Nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ựến khi xuất hiện màu.
Bước 7: nhuộm nhân tế bào
Nhuộm bằng Hematoxylin (30s), làm sạch, gắn lamen và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.