Chó bị bệnh do Parvovirus sau khi quan sát tổn thương ựại thể, tiến hành lấy bệnh phẩm ngâm trong dung dịch formol 10% ựể tiến hành làm tiêu bản vi thể, tiêu bản hóa mô miễn dịch. Chúng tôi lấy bệnh phẩm gồm: ruột non, ruột già, dạ dày, hạch màng treo ruột, tim, gan, lách, phổi.
Mỗi con chó bệnh chúng tôi tiến hành lấy trên mỗi cơ quan có tổn thương 3 miếng bệnh phẩm ở 3 vị trắ khác nhau và ựúc thành 3 block. Mỗi block ựược chúng tôi cắt và làm tiêu bản rồi chọn 3 tiêu bản ựẹp nhất quan sát các tổn thương vi thể, nếu tế bào có tổn thương ựược ký hiệu là +.
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm ựúc bằng Parafin, cắt dán tiêu bản và nhuộm Hematoxylin Ờ Eosin. Phương pháp bao gồm các bước sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 ựựng hóa chất, phiến kắnh, máy ựúc block, khuôn ựúc, tủ ấm 370C, máy cắt microtom, nước ấm 48 -520C, Xylen, Paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, EosinẦ
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là lách, hạch màng treo ruột, ruột, dạ dày, gan thận, não, phổi.
Cố ựịnh bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (thể tắch Formol gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong Formol).
Vùi bệnh phẩm: bao gồm các bước sau
+ Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 -5 mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựa. đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h ựể rửa sạch Formol.
+ Chạy mẫu: ựưa mẫu vào hệ thống các bình ựựng hóa chất trong 54h (bảng 3.1). Lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
Bảng 3.1. Quy trình chuyển ựúc mẫu
Bình Hóa chất Thời gian (h)
1 Cồn 700C 3:00 2 Cồn 800C 3:00 3 Cồn 960C 3:00 4 Cồn 1000C 12:00 5 Xylen 3:00 6 Xylen 3:00 7 Xylen 3:00 8 Paraffin 6:00 9 Paraffin 6:00 10 Paraffin 12:00
+ đúc block: ựặt miếng bệnh phẩm vào chắnh giữa khuôn block, ựổ nhanh Paraffin lỏng vào khuôn block. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội ựến khi block ựông cứng, ựặc chắc là ựược.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35 5 ộm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức. Sau ựó, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt ựều, lấy phiến kắnh hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 Ờ 520C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. để tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin Ờ Eosin.
Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau
+ Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút Xylen III : 10 phút
+ Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc Cồn 1000C : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950C : 1 lần Cồn 700C : 1 lần Cồn 500C : 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5 Ờ 10 phút.
+ Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản. để khoảng 3 Ờ 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản màu xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu ựậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960C + HCl 1%) trong 30 giây. + Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 Ờ 5 phút, sau ựó rửa nước chảy 5 Ờ 10 phút cho hết Eosin thừa.
+ Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt ựối, mỗi lọ 1 phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 36 + Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
+ đánh giá kết quả: ựem soi lên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.