a) Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl cellulose) bằng enzym ở pH = 5,0 và 400C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng
đường khử, đường khử sẽ phản ứng với axit 3,5- dinitrosalicylic và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sĩng 540nm
b) Cách thực hiện:
Phản ứng enzym:
• Hút 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm (18x130mm) và để ổn định ở nhiệt độ 40 ± 0.10C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
• Thêm 1ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều.
• Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40 ± 0,1 0C, 10 phút.
• Thêm vào 4ml dung dịch DNS, lắc đều thật kĩ để ngừng phản ứng enzym . • Để tránh sự bốc hơi nước, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy
miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sơi trong 15 phút.
• Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phịng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh.
• Đo độ hấp thu OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng. (AT)
Phản ứng thử khơng:
• Hút 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm (18x130mm) và để ổn định nhiệt ở nhiệt độ 40± 0.10C. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
• Thêm vào 4ml dung dịch DNS. Lắc đều.
• Thêm 1ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều.
• Để tránh sự bốc hơi nước, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sơi trong 15 phút.
• Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phịng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh.
• Đo độ hấp thu OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng. (AB)
• Hút lần lượt 1ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm (18 x 130mm).
• Thêm vào 1ml dung dịch cơ chất và lắc đều. • Thêm vào 4ml dung dịch DNS. Lắc đều.
• Dán nilon hay parafilm lên miệng ống nghiệm, đặt vào nồi nước sơi trong 15 phút.
• Đưa về nhiệt độ phịng bằng nồi nước lạnh .
• Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (AG)
• Đối với nước cất: Làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nước cất. Đo OD 540 nm. (AW)
Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính CMCase được định nghĩa là số lượng enzym cần thiết để giải phĩng ra đường khử (glucose) ở tốc độ µmol/phút dưới các điều kiện thực nghiệm.
c) Tính tốn:
Tính hệ số glucose:
• Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch đường glucose chuẩn bằng cách: AG-AW.
• Đối với mỗi nồng độ pha lỗng dựng đường biểu diễn sự biến thiên giữa OD và nồng độ glucose (mg/ml). Đường này phải là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch đường chuẩn để thu được giá trị hệ số glucose (mg/ml), tính giá trị hệ số trung bình.
Hệ số glucose được tính bằng cơng thức:
Trong đĩ:
F: Hệ số glucose. F=
AG - AW CG(mg/ml)
CG: Nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml). AG: Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn. AW: Độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất.
Xác định hoạt tính enzym: Sử dụng cơng thức sau:
CMCase(u/g)=(AT-AB)*F* * * *
Trong đĩ:
AT: Độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzym. AB: Độ hấp thu OD của phản ứng thử khơng.
F: Hệ số glucose (mg/ml). 1000: Chuyển từ mg sang µg.
180 : Trọng lượng phân tử của glucose đổi từ µg sang µmol. 10 phút: thời gian phản ứng.
C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).