và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. ðối tượng và ủịa ủiểm nghiờn cứu
−Thớ nghiệm xử lý ủột biến bằng colchicine ủược tiến hành trờn giống hoa ủồng tiền kộp, màu trắng nhị nõu. Bộ phận xử lý là chồi in vitro.
−Thớ nghiệm xử lý ủột biến bằng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) ủược tiến hành trờn giống hoa ủồng tiền kộp, mầu ủỏ nhị nõu. Bộ phận xử lý là callus.
−Hai giống ủồng tiền này ủều cú nguồn gốc từ Hà Lan, nhập nội vào Việt Nam từ Cụn Minh, Trung Quốc.
−Tỏc nhõn vật lý gõy ủột biến là tia γ nguồn Co60, chiếu xạ ủược thực hiện tại trung tõm chiếu xạ Quốc Gia- Cầu Diễn – Hà Nội.
−Tỏc nhõn gõy ủột biến hoỏ học là colchicine (acetyl trimethyl colchicine)
−Cỏc thớ nghiệm ủược tiến hành tại phũng thớ nghiệm, vườn thực nghiệm Viện Sinh học Nụng nghiệp, trường ðại học Nụng nghiệp I, Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Xử lý chồi đồng tiền bằng colchicine
a. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ và thời gian xử lý colchicine đến chồi đồng tiền nuôi cấy mô.
Bao gồm 3 thí nghiệm nhỏ với 12 công thức, trong đó có 9 công thức xử lý colchicine (xử lý với 3 nồng độ 0,01%; 0,05%; 0,1% và 3 thời gian khác nhau 24h, 48h, 72h) và 3 công thức đối chứng (không xử lý colchicine nh−ng ngâm mẫu trong 3 thời gian khác nhau 24h, 48h, 72h). Mỗi công thức xử lý 25 chồi.
b. Thí nghiệm 2: Phân loại các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý colchicine qua một số chỉ tiêu hình thái thực vật, chỉ tiêu sinh lý .
c. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng duy trì ổn định các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý colchicine in vitro.
d. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ bội của các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý colchicine
e. Thí nghiệm 5: Đánh giá khả năng sinh tr−ởng của các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý colchicine in vitro (về hệ số nhân, khả năng ra rễ).
f. Thí nghiệm 6: Theo dõi, đánh giá sinh tr−ởng của các dạng cây ngoài v−ờn −ơm
3.2.2. Xử lý đột biến callus đồng tiền bằng chiếu xạ tia gamma nguồn Co60
g. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh h−ởng của liều l−ợng chiếu xạ đến tỷ lệ sống và khả năng sinh tr−ởng của callus đồng tiền.
Callus đ−ợc xử lý với 8 liều chiếu khác nhau: 0 Krad, 3 Krad, 6Krad, 9 Krad, 12 Krad, 15 Krad, 18 Krad, 21 Krad. Mỗi liều chiếu 45 mẫu.
h. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh h−ởng của liều l−ợng chiếu xạ đến khả năng phát sinh chồi của callus đồng tiền.
i. Thí nghiệm 9: Nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của các chồi đồng tiền thu đ−ợc sau khi tái sinh từ các liều chiếu xạ khác nhau in vitro.
k. Thí nghiệm 10: Nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng của các chồi đồng tiền thu đ−ợc sau khi tái sinh từ các liều chiếu xạ khác nhau ở v−ờn −ơm.
l. Thớ nghiệm 11: Nghiên cứu khả năng sinh tr−ởng, phát triển, màu sắc hoa của các chồi đồng tiền thu đ−ợc sau khi tái sinh từ các liều chiếu xạ khác nhau ở sản xuất.
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
* Sử dụng các biện pháp nuôi cấy mô hiện hành
* Cách bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi, điều tra đều theo ph−ơng pháp nghiên cứu nông sinh học thông dụng.
3.3.1. ðiều kiện tiến hành thớ nghiệm.