+ Cường ủộ ỏnh sỏng: 2000 Lux. + ðộẩm ~ 60%.
+ Nhiệt ủộ: 25 ± 20C.
+ Chu kỳ chiếu sỏng: (10 – 12)/24h.
- Mụi trường nuụi cấy mụ sử dụng trong thớ nghiệm:
+ Sử dụng mụi trường nền là MS (Murashige & Skook) + pH mụi trường trước khử trựng: 5.8
+ Mụi trường thớch hợp ủể tạo thể tiền chồi (M1): MS + 1ppm BAP + 0.2ppm Ki + 0.2ppm IAA + 2.5% Saccaroza + 6.2g Agar/l.
+ Mụi trường thớch hợp cho quỏ trỡnh nhõn nhanh chồi in vitro (M2): MS + 1ppm Ki + 2.5% Saccaroza + 6.2g Agar/l.
+ Mụi trường ra rễ cho chồi in vitro (M3): MS + 0.1ppm αNAA + 2.5% Saccaroza + 6.2g Agar/l.
+ Mụi trường dựng ủể xử lý ủột biến chồi là mụi trường lỏng (M4): MS + 2.5% Saccaroza.
+ Mụi trường giỳp cõy sinh trưởng (to, mập) nhưng khụng ủẻ chồi (M5): MS + 2.5% Saccaroza + 6.2g Agar/l .
+ Giỏ thểở giai ủoạn vườn ươm là cỏt+ trấu hun (1:1).
3.3.2. Cỏc phương phỏp tiến hành
3.3.2.1. Ph−ơng pháp xử lý chồi đồng tiền bằng colchicine
Các chồi đồng tiền sau khi tái sinh từ cơ quan nuôi cấy ban đầu đ−ợc tách thành cụm và cấy sang môi tr−ờng nhân nhanh tối −u: MS + 1mg/l Kinetin + 10% n−ớc dừa + 6,5g/l agar. Sau lần cấy chuyển thứ 3 (thời gian cho 1 lần cấy chuyển là 4 tuần) đ−ợc sử dụng làm thí nghiệm.
Ph−ơng pháp tiến hành: Các cụm chồi đang trong giai đoạn sinh tr−ởng mạnh nhất đ−ợc tách thành từng chồi riêng rẽ cắt bỏ lá tạo thành những chồi có chiều cao từ 1,0 đến 1,5 cm . Colchicine đ−ợc khử trùng bằng màng lọc vô trùng (Millipore Sterivex GS, 0,22 àm; 1 atm) và đ−ợc bổ sung trực tiếp vào bình môi tr−ờng lỏng đp đ−ợc chuẩn bị sẵn. Tiến hành ngâm các chồi trong môi tr−ờng lỏng có bổ sung colchicine nồng độ (%) khác nhau: 0,01%; 0,05%; 0,1% (trọng l−ợng/thể tích môi tr−ờng ).
Mỗi công thức xử lý 25 chồi. Trong thời gian xử lý colchicine các bình mẫu đ−ợc để trên máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút và che tối hoàn toàn.
Sau khi xử lý xong các chồi thí nghiệm đ−ợc rửa sạch bằng n−ớc cất vô trùng và chuyển sang môi tr−ờng nhân nhanh có agar và nuôi cấy ở điều kiện bình th−ờng. Sau 30 ngày nuôi cấy tiến hành cấy chuyển 1 lần và sau 60 ngày (t−ơng đ−ơng với 2 lần cấy chuyển) tiến hành kiểm tra sự thay đổi hình thái.
3.3.2.2. Ph−ơng pháp xử lý callus đồng tiền bằng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60)
Thớ nghiệm chiếu xạủược tiến hành trờn giống ủồng tiền kộp hoa ủỏ nhị
nõu.
Mẫu cấy ủược chọn là nụ hoa non ủược rửa sạch, khử trựng bằng nước zaven trong 10 phỳt sau ủú khử trựng lại bằng HgCl2 0.1% trong 5 – 7 phỳt. Sau khi khử trựng, mẫu ủược rửa sạch (3 - 4 lần) bằng nước cất vụ trựng. Nụ
hoa ủó khử trựng ủược cấy vào mụi trưũng tạo callus M1. Sau khi callus hỡnh thành, chỳng tiếp tục ủược cấy vào mụi trường nhõn callus và tạo kớch thước
ủủ lớn cho việc chiếu xạ (ủường kớnh của khối callus trung bỡnh khoảng 0.5 – 1 cm). Sau khi kiểm tra kĩ lưỡng cỏc khối callus, chọn ra những callus cú khả
năng sinh trưởng, phỏt triển mạnh nhất ủem ủi chiếu xạ.
Cỏc callus ủược chiếu ở cỏc liều: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 krad. Cỏc mẫu
ủược chiếu cựng thời gian, cú số mẫu là 45 mẫu trờn 1 CT.
Cỏc mẫu sau chiếu xạ ủược cấy vào mụi trường tỏi sinh M1 ủể duy trỡ khả năng sống, tỏi sinh và ủỏnh giỏ ảnh hưởng của cỏc liều chiếu lờn khối callus ủể tỡm ra cỏc ngưỡng sống, ngưỡng gõy chết của cỏc liều chiếu lờn khối callus.
Sau 90 ngày nuụi cấy (tương ủương 3 lần cấy chuyển, 30 ngày cấy chuyển 1 lần) ủó cú thể ủỏnh giỏ ủược ảnh hưởng của cỏc liều chiếu lờn cỏc khối callus, xỏc ủịnh ủược liều chiếu gõy chết, liều gõy ức chế sinh trưởng, phỏt triển của khối callus.
3.3.2.3. Quan sát sự thay đổi hình thái, mức bội thể của các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý
- Chúng tôi tiến hành đo các chỉ tiêu chiều cao cây, số lá, chiều dài cuống lá, đ−ờng kính cuống lá, đánh giá độ dày mỏng, màu sắc, bề mặt lá…giữa cây đối chứng với các dạng cây thu đ−ợc sau xử lý để xác định sự sai khác về mặt hình thái bên ngoài.
- Đối với những dạng cây thu đ−ợc sau chiếu xạ đ−ợc đánh giá ngoài đồng ruộng thông qua sinh tr−ởng phát triển, màu sắc hoa, khả năng chống chịu…
3.3.2.4. Xác định mức bội thể của các dạng cây thu đ−ợc bằng ph−ơng pháp Flow cytometry (tiến hành ở viện Di truyền Nông nghiệp, HN)
- Chuẩn bị mẫu: bộ phận làm mẫu phân tích là lá cây đồng tiền in vitro
đp thành thục. Dùng dao sắc, nhọn cắt khoảng 30 – 50mg mô lá cho vào đĩa petri có ch−a 0,4 ml dung dịch đệm (không có RNAse) DAPI (của hpng Partee) chúng ta thu đ−ợc huyền phù nhân tế bào. Tiến hành lọc huyền phù qua màng lọc nilon (d = 30àm). Sản phẩm thu đ−ợc sau khi lọc đ−ợc bổ sung thêm 1,6 ml dung dịch nhuộm DAPI và ủ 5 phút tr−ớc khi đ−a vào máy phân tích.
- Phân tích mẫu: Mức bội thể của tế bào đ−ợc xác định thông qua hàm
l−ợng AND trong nhân tế bào mà máy đo đ−ợc. Hàm l−ợng AND của cây hoa đồng tiền Nam Phi làm thí nghiệm nhị bội đp biết rõ số l−ợng NST là 2n = 50 đ−ợc sủ dụng làm đối chứng. Giá trị trung bình của AND của cây đồng tiền đa bội phải gấp hai lần giá trị của cây nhị bội, gía trị của cây tam bội nằm ở giữa hai giá trị đa bội và nhị bội. Chúng tôi lần l−ợt tiến hành so sánh mức độ bội giữa cây đối chứng với các dạng cây thu đ−ợc (4 dạng cây) sau xử lý colchicine.
3.3.2.5. Xỏc ủịnh mật ủộ, kớch thước khớ khổng, lục lạp
Bước 1. Lấy mẫu: mẫu lấy quan sỏt là mẫu xử lý sau 3 lần cấy chuyển
ủó xuất hiện chồi và lỏ mới, những lỏ cỏch ủỉnh sinh trưởng 1 – 2 bỳp lỏ sẽ ủược ủem kiểm tra.
Bước 2. Dựng dao nhọn nhẹ nhàng tỏch lớp màng lỏ ủặt lờn phiến kớnh, nhỏ 1 giọt nước cất và quan sỏt dưới kớnh hiển vi cú ủộ phúng ủại 400 lần ủể
kiểm tra kớch thước khớ khổng và lục lạp.
3.3.2.6. Xỏc ủịnh cỏc chỉ tiờu sinh lý: Cường ủộ quang hợp, hiệu suất quang hợp, cường ủộ thoỏt hơi nước, hàm lượng diệp lục, diện tớch lỏ