Chromatography - HPLC)
2.7.5.1. Cơ sở lý thuyết
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái ựầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra ựời từ năm 1967- 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ ựiển
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 20
(đào Hữu Vinh, 1985). Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện ựại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tắch. Do vậy, nó ựược áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm ựặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc và hiện là công cụ ựắc lực trong phân tắch các thuốc ựa thành phần cho phép ựịnh tắnh và ựịnh lượng.
Ưu ựiểm của HPLC:
đặc hiệu cho chất cần phân tắch.
độ nhạy cao.
độ ổn ựịnh cao.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chắnh ựược áp dụng hiện nay ựể xác ựịnh dư lượng rất nhỏ các kháng sinh trong thực phẩm. Các Tetracycline ựược chiết và làm sạch bằng chiết pha rắn, sau ựó ựịnh lượng trên sắc ký lỏng sử dụng các ựầu dò (detector) UV hoặc PDA.
Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách trong ựó pha ựộng là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất mang ựã ựược biến ựổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao ựổi ion hay phân loại theo kắch cỡ.
Phân loại sắc ký
Cách phân loại sắc ký lỏng phổ biến nhất là dựa trên sự tương tác của chất phân tắch với pha tĩnh, theo ựó có thể chia ra 5 loại sắc ký dựa trên 5 cơ chế tách khác nhau: hấp phụ (adsorption), phân bố (partition), loại trừ theo kắch cỡ (size exclusion), ái lực (affinity) và trao ựổi ion (ion exchange).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 21
Hình 2: Sơ ựồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1. Bình chứa dung môi, 2. Ống dẫn dung môi, 3. Bơm, 4. Bộ phận bơm mẫu, 5. Cột sắc ký, 6. Detector, 7. đường thải dung môi, 8. Bộ phận ghi và
xử lý tắn hiệu.
Một hệ thống sắc ký lỏng bao gồm các bộ phận cơ bản như trong hình 2, gồm:
Bình chứa dung môi pha ựộng, ống dẫn dung môi, bơm dung môi: các bộ phận này có nhiệm vụ ựẩy dung môi pha ựộng ựi qua cột sắc ký ựể thực hiện quá trình phân tách các chất trong mẫu. Trong thực tế, pha ựộng thường chứa hai loại dung môi trở lên, vì vậy còn có thêm bộ phận trộn dung môi và bộ phận ựiều khiển dòng dung môi.
Bộ phận bơm mẫu: là bộ phận ựưa mẫu phân tắch ựã ựược xử lý, làm sạch vào hệ thống trước khi mẫu ựược dung môi pha ựộng ựẩy qua cột. Có hai kiểu bơm mẫu là bơm mẫu bằng tay, sử dụng một kim bơm bên ngoài ựể hút dung dịch mẫu và ựẩy vào vòng chứa mẫu. Một kiểu khác là bơm mẫu tự ựộng, bộ phận bơm mẫu gồm kim bơm mẫu và các bộ phận hỗ trợ như hệ thống ựịnh vị các ống chứa mẫu ựược thiết kế sẵn bên trong hệ thống sắc ký. Mẫu ựược hút và bơm vào hệ thống một cách hoàn toàn tự ựộng và ựược ựiều khiển bằng phần mềm.
Cột sắc ký: mặc dù cột sắc ký là bộ phận quan trọng nhất nhưng thường lại là bộ phận nhỏ nhất trong hệ thống. Cột sắc ký là nơi xảy ra tương tác của các chất tan trong mẫu với dung môi pha ựộng và pha tĩnh (chất nhồi trong cột), là nơi xảy ra quá trình Ộsắc kýỢ. Có nhiều loại cột sắc ký với cấu tạo chất nhồi khác nhau ựể ựáp ứng việc tách các chất theo từng phương pháp sắc ký khác nhau. Vắ dụ trong sắc ký ion cần sử dụng các cột
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 22
sắc ký ion (cột cation hoặc anion). Trong sắc ký phân bố pha ngược cần sử dụng các loại cột pha ngược (C8, C18, phenylẦ), còn trong sắc ký phân bố pha thường lại cần sử dụng các cột thường như cột silica, NH2...
đầu dò (hay detector): là bộ phận phát hiện các chất trong mẫu sau khi ựã ra khỏi cột sắc ký và ựược tách khỏi nhau. Dựa vào bản chất hóa lý của chất phân tắch mà có các loại ựầu dò phù hợp. Tắn hiệu ựược phát hiện bởi ựầu dò thường ựược khuếch ựại trước khi chuyển sang bộ phận ghi tắn hiệu.
Bộ phận ghi tắn hiệu thường ựược kết nối với máy tắnh ựể xử lý kết quả. Trong các hệ thống sắc ký hiện ựại thường có các phần mềm ựể ựiều khiển toàn bộ hoạt ựộng của hệ thống và xử lý các kết quả phân tắch.
2.7.5.3. Các loại ựầu dò trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hầu hết các loại ựầu dò hiện nay ựều có thể ựược ứng dụng trong sắc ký lỏng ựể phân tắch thực phẩm. Mỗi loại có những ưu ựiểm và nhược ựiểm riêng.
Bảng 3: Các loại ựầu dò thường dùng
TT Tắnh chất ựể phát hiện Tên ựầu dò
1 Sự phát xạ của nguyên tử đo phổ phát xạ nguyên tử 2 Hấp thụ quang UV- VIS đo phổ UV hay UV- VIS 3 Huỳnh quang đo phổ huỳnh quang
+ đo dòng ( Cực phổ) 4 Tắnh chất ựiện hóa: ( độ dẫn
ựiện, dòng, thế...) + đo ựiện trở và ựo thế 5 Chỉ số chiết xuất đo chiết suất
6 độ dẫn nhiệt đo ựộ dẫn nhiệt 7 Về khối lượng ion chất Khối phổ (MS)
(Nguồn: Phạm Luận, 1999)
Giới thiệu về ựầu dòUV-VIS
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 23
ựộng dựa trên sự hấp thụ UV (Ultra Violet) của chất phân tắch. Mặc dù còn nhiều hạn chế do không phát hiện ựược những chất tan không phân cực do chúng không hấp thụ UV nhưng loại ựầu dò này vẫn là có sự kết hợp tốt nhất của các ựặc tắnh: ựộ nhạy, tắnh tuyến tắnh, tắnh ựa năng và ựộ tin cậy trong tất cả các loại ựầu dò của sắc ký lỏng.
Cấu tạo của 1 ựầu dò loại này gồm: 1 tế bào ựo hình trụ có dung tắch từ 1-10ộl ựể cho dung môi rửa giải chảy qua. Ánh sáng sẽ ựi qua tế bào ựo và tới tế bào quang ựiện. đầu ra từ tế bào quang ựiện sẽ ựi qua bộ phận khuếch ựại và tới bộ phận xử lý dữ liệu.
Việc sử dụng ựầu dò UV cần phải chú ý tới khả năng hấp thụ UV của dung môi. Trong sắc ký pha ựảo, dung môi thường ựược dùng là nước, Methanol (MeOH), Acetonitril (ACN) và Tetrahydrofuran, là những chất ắt hấp thụ UV. Do ựó ựầu dò UV thường ựược sử dụng trong sắc ký pha ựảo. Còn dung môi dùng trong sắc ký pha thuận thường có khả năng hấp thụ UV mạnh nên cần thận trọng trong việc lựa chọn dung môi.
Trong ựầu dò UV ựược chia làm hai loại: ựầu dò ựo ở bước sóng cố ựịnh và ựầu dò ựo ở bước sóng thay ựổi.
đầu dò UV ựo ở bước sóng cố ựịnh: ở ựây sử dụng ựơn sắc ựược tạo ra bởi 1 ựèn phóng ựiện ựặc biệt. Có 3 loại ựèn thường dùng là ựèn hơi Hg, ựèn Cadimi, ựèn Zn trong ựó ựèn Hg tạo ra ựược ánh sáng ựơn sắc nhất và hay ựược sử dụng nhất. Loại ựầu dò này có ựộ nhạy khá cao, tới 5.10-8 g/ml.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 24 đầu dò UV ựo ở bước sóng thay ựổi: chùm sáng ựa sắc từ ựèn deuterium ựược hội tụ vào khe của bộ phận ựơn sắc (monochromator) nhờ các gương phẳng và gương cầu. Bộ phận ựơn sắc chỉ truyền một phần chọn lọc (một dải hẹp của ánh sáng) qua khe thứ 2 (slit). Chùm sáng từ ựó ựi qua mẫu trong cuvet dòng chảy (flow cell) và bị hấp thụ một phần bởi dung dịch mẫu. độ hấp thụ của mẫu ựược xác ựịnh bằng cách ựo cường ựộ ánh sáng tới bộ phận nhận quang (photomultiplier) của mẫu trắng so với mẫu thử.
Hình 4: Sơ ựồ hoạt ựộng của ựầu dò ựo ở bước sóng thay ựổi
2.7.5.4. Một số ựại lượng ựặc trưng của HPLC
Thời gian lưu:
Khi ựược bơm vào cột sắc ký các chất phân tắch sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất ựịnh, ựó chắnh là thời gian lưu của chất phân tắch tắnh từ lúc mẫu ựược nạp vào cột cho ựến khi chất tan ựược rửa giải khỏi cột ở ựiểm có nồng ựộ cực ựại:
tRi = to + tỖRi
Trong ựó: to là thời gian chết (thời gian chất phân tắch nằm trong pha ựộng) tỖRi là thời gian lưu giữ thực của chất phân tắch trên cột tách
Số ựĩa lý thuyết
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 25 16.(tRi- to) tR2 3.14.(h.tR)2 N = Wi2 = 5,54. W1/22 = 2. A2
Trong ựó: tRi là thời gian lưu của chất phân tắch I trên cột tách to là thời gian không lưu trữ
Wi là chiều rộng ựáy chân pic
W1/2 là chiều rộng ựo ở nửa chiều cao pic h là chiều cao pic
A là diện tắch pic
Khi giá trị N quá bé thì các chất phân tắch không ựược tách tốt hoặc quá trình tách xảy ra không hoàn toàn. Ngược lại khi giá trị N quá lớn thì sẽ làm giảm các pic của các chất sẽ cách nhau quá xa khiến việc rửa giải tốn nhiều dung môi. Thực tế với các mẫu chạy HPLC thường N nằm trong khoảng 4000 ọ 7500 là vừa ựủ
Hệ ựối xứng pic
để ựánh giá tắnh ựối xứng pic sắc ký ta có thể dùng hệ số ựối xứng F ựược tắnh như sau:
W F=
2a
Trong ựó: W là chiều rộng pic ựo ở 1/20 chiều cao của pic
A là khoảng cách từ chân ựường vuông góc hạ từ ựỉnh pic ựến mép ựường cong phắa trước tại vị trắ 1/20 chiều cao pic
Ta cũng có thể ựánh giá tắnh cân xứng theo công thức: B
S= A
A là khoảng cách từ chân ựường vuông góc hạ từ ựỉnh pic ựến mép ựường cong phắa trước tại vị trắ 1/10 chiều cao pic
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 26
B là khoảng cách từ chân ựường vuông góc hạ từ ựỉnh pic ựến mép ựường cong phắa sau tại vị trắ 1/10 chiều cao pic
S = 1,0 ọ 1,05 là pic lý tưởng S = 1,5 là chấp nhận ựược S = 2,0 là pic xấu
S = 4,0 là pic xấu
Hệ số tách α
Hệ số tách α là ựại lượng ựánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc ký và là tỉ số thời gian lưu của 2 chất: α = tỖA/tỖB
điều kiện cần thiết ựể 2 chất A và B tách ra khỏi nhau là α ≠ 1. α càng lớn thì hai chất tách khỏi nhau càng rõ ràng
Khi α = 1 thì hai chất không có sự tách do lúc này chúng cùng nằm trong một pic
Khi α ~1 thì hai chất có pic chung một vùng, tức là pic bị chập lại, cũng không thể tách ra làm 2 pic riêng biệt ựặc trưng
độ phân giải R
độ phân giải R nói lên mức ựộ tách ra khỏi nhau của hai chất A và B 2.(tỖRA- tỖRB)
R=
WA + WB
Ở ựây tỖRA và tỖRB là thời gian lưu thực của các chất A và B WA và WB là chiều rộng ựáy pic của A và B
Theo quy luật phân bố của Gaoxo và Rayley, ựiều kiện tối thiểu ựể cho 2 chất A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trắ cực ựại của B, và ựể tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phắa sau A phải kề với cực tiểu phắa sau pic A, tức là RAB = WA + WB
2.7.5.5. Phân tắch bằng HPLC
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 27 Máy HPLC phải ựược kiểm chứng và bảo trì theo ựịnh kỳ ựể bảo ựảm máy họat ựộng tốt cho kết quả phân tắch có ựộ ựúng, ựộ lặp lại, tuyến tắnh, tỷ lệ dung môi, tốc ựộ dòng... ựúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất ựặt ra.
Lựa chọn tỷ lệ ACN hay MeOH/Nước sao cho phù hợp ựể làm sạch hết các chất còn ựọng lại trong cột ựồng thời ựể bảo vệ cột không bị mốc khi ựể lâu. Tuyệt ựối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau ựó ựể cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng ựược. Lưu ý, nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể ựáp ứng ựược các yêu cầu phân tắch.
Chuẩn bị dung môi pha ựộng
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC. Pha dung môi ựúng, chắnh xác theo ựúng tỷ lệ. Lọc dung môi qua màng lọc, siêu âm ựể ựuổi bọt khắ.
Chuẩn bị mẫu ựo HPLC
Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo ựúng quy trình và theo nguyên tắc sau:
Ớ Dung môi phải hòa tan trong pha ựộng, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha ựộng ựể hòa tan mẫu.
Ớ Phải loại bỏ các chất không tan trong pha ựộng hoặc không rửa giải ựược bằng cách lọc hay chiếtẦ
Ớ Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc.
Ớ Nồng ựộ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng ựộ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng ựộ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tắnh ựã khảo sát của từng thành phần.
Cách ựo HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 28
ống dẫn trước khi cho vào cột.
đặt ựầy ựủ các ựiều kiện phân tắch như:
Ớ Cấu hình máy.
Ớ Tỷ lệ các dung môi pha ựộng.
Ớ Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tắch yêu cầu.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 29
PHẦN 3: VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU