(Chú ý: Tiến hành kỹ thuật trong ựiều kiện tránh ánh sáng trực tiếp. Quá trình chiết xuất và làm sạch cần ựược thực hiện trong 1 ngày).
1. Xử lý mẫu sơ bộ
Mẫu ựược xay kỹ bằng máy nghiền mẫu thực phẩm ựến mịn và ựồng nhất.
2. Chiết xuất các kháng sinh nhóm tetracycline từ thịt
Cân 5,00 ổ 0,05g mẫu vào ống ly tâm polypropylen 50ml. Và nạp vào 5.00g mẫu trắng với nồng ựộ kháng sinh có trong mẫu 0,5ộg/g bằng cách thêm 100ộl hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc 25ộg/ml. (Mẫu trắng cũng ựược làm cho mỗi lần chiết mẫu thử ựể biết pắc tạp có trong mẫu).
Thêm 20ml dung dịch ựệm McIlvaine-EDTA vào mỗi ống ly tâm, và nghiền mẫu trong 30 giây, rửa ựầu nghiền bằng 2ml dung dịch ựệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm (lắc kỹ trên voxte, sau ựó siêu âm 30 phút).
đậy lắp ống ly tâm và lắc 10 phút trên máy lắc mặt bằng ở tốc ựộ cao, sau ựó ly tâm 10 phút ở 3000-5000 vòng/phút. Rót dịch trong phắa trên (supernate) vào ống ly tâm thứ 2.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 33 Chiết thêm 2 lần x 10ml/lần dung dịch ựệm McIlvaine-EDTA và lặp lại các bước chiết như trên. Gộp tất cả dịch chiết ba lần vào ống ly tâm thứ 2. Thêm 3ml trichloracetic acid 50% (0,5g/ml) vừa cho vừa lắc nhẹ trong 1 phút.
Lọc dịch chiết bằng giấy lọc dùng phễu Buchner và làm ướt bằng dung dịch ựệm McIlvaine-EDTA vào bình 125ml (sidearm flash), áp chân không nhẹ qua sidearm. Rửa ống ly tâm với 2ml McIlvaine-EDTA và lọc tiếp.
3. Giai ựoạn làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE)với các bước
Chuẩn bị SPE lên bộ hút chân không cho SPE. Hoạt hóa SPE lần lượt với 20ml MeOH và 20ml nước cất. Bỏ dịch chảy ra từ SPE.
Chuyển toàn bộ dịch chiết trên vào SPE, rửa bình 2 lần với 2ml McIlvaine-EDTA rồi ựưa tiếp vào SPE; tiếp tục lại rửa bình với 20ml nước cất cho vào SPE. Sau ựó hút chân không liên tục qua SPE cho ựến khô trong 3 phút.
đưa bình ựịnh mức 10ml vào hứng dịch từ mỗi ống SPE. Rửa giải Tetracyclin từ SPE bằng 6ml axắt oxalic trong MeOH 0,01M, hút ựến hết dịch chảy ra khỏi SPE và hút chân không thêm 10 giây. định mức ựến vạch bằng nước cất. Lọc dịch cuối trước khi bơm vào HPLC bằng màng lọc 0,45 ộm.