Phương pháp này dùng ñểñịnh lượng vi khuẩn hiếu khí tổng số, E. coli,
Salmonella spp, Staphylococcus spp, Vibrio spp
- Dựa theo phương pháp ñịnh lượng vi khuẩn (ñếm số khuẩn lạc trực tiếp trên môi trường nuôi cấy) của S.D Millar và G.N. Frerchs, 1993) [36].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 28 - Ngoài ra có tham khảo bổ sung một số theo một số nguồn tài liệu như sau: + TCVN 4884: 2005 (ISO 4833: 2003), Xác ñịnh tổng số vi khuẩn hiếu khí [23] + TCVN 6846: 2007 (ISO 7251: 2005), Xác ñịnh E.coli [26] + TCVN 4830 - 1: 2005 (ISO 6888 - 1: 1999, Amd 1: 2003), Xác ñịnh Staphylococus aureus [22]. + TCVN 4829: 2005 (ISO 6579: 2002), Xác ñịnh Salmonella [21] + TCVN 7905, 2008 (ISO/TS 21872 - 2: 2007), Phương pháp phát hiện
Vibrio spp có khả năng gây bệnh ñường ruột [28].
Hình 2. 2. Các bước tiến hành ñịnh lượng vi khuẩn * Dụng cụ và môi trường
- Pipet 10ml và 1ml, que dàn thuỷ tinh, cối chầy sứ, ống nghiệm khử trùng, máy trộn (Vortex), nước muối 2% và dung dịch ñệm phosphat khử trùng.
- ðĩa môi trường nuôi cấy vi khuẩn: NA, S.S. Agar, Chapman, TCBS, Macconkey. 10- 1 10-3 10-4 Mẫu tôm 10-2 1ml 1ml 1ml 1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 29 - Cân 10 gam mỗi mẫu tôm cho vào cối chày sứ ñã khử trùng và tiến hành các thao tác pha loãng mẫu từ 10o ñến 10-4 tương tự như ñã trình bày trong phương pháp ñịnh lượng Fecal coliform.
- Dùng pipet lấy 0.1 ml hỗn hợp ñã pha loãng ở 2 - 3 mức khác nhau và trang ñều trên ñĩa môi trường chọn lọc ñối với từng loại vi khuẩn bằng que gạt thủy tinh. Mỗi ñộ pha loãng nuôi cấy từ 2 - 3 ñĩa lồng (Hình 2.2)
* ðọc kết quả.
- Trên ñĩa môi trường NA, ủở 28 - 30oC trong 18 - 24h, ñếm số khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí tổng số.
- Trên ñĩa môi trường Macconkey agar, ủở 28 - 30oC trong 18 - 24 giờ, ñếm số khuẩn lạc có màu ñỏ cánh sen, xung quanh có vùng mờ sương của
E.coli
- Trên ñĩa môi trường Bismuth sulphate agar (S.S.agar), ủ ở 35oC/40 - 48 giờ, ñếm số khuẩn lạc màu ñen óng ánh kim loại (hoặc khuẩn lạc nhạt màu) của Salmonella
- Trên ñĩa môi trường Chapmen, ủ ở 28 - 30oC/24 - 48 giờ, ñếm số khuẩn lạc màu vàng của Staphylococcus
- Trên ñĩa môi trường TCBS, ủ ở 30oC/18-24 giờ, ñếm số khuẩn lạc màu vàng (ñường kính 2 - 3mm) của V. cholerae và màu xanh (ñường kính 3 - 5mm) của Vibrio parahaemolyticus.
Khi ñếm số lượng khuẩn lạc trên mặt ñĩa môi trường. Nếu số lượng nhiều ta có thể chia ô ñể ñếm. Tính số lượng vi khuẩn trong 1 gam tổ chức theo công thức dưới ñây:
A = X. 1/ K.V
Trong ñó: A: là số khuẩn lạc trên 1 gam tổ chức. ðơn vị tính: cfu/g, X: số
khuẩn lạc trung bình mọc trên ñĩa môi trường khi cấy ở một hệ số pha loãng, V: thể tích (ml) mẫu ñã dùng ñể cấy và K: hệ số pha loãng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 30