Dùng ñểñịnh lượng chỉ tiêu Fecal Coliform trên tôm sú thương phẩm Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu ñược pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng ñộ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần), 3 hoặc 5 mẫu có ñộ pha loãng thập phân liên tiếp ñược ủ trong ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng ñộ pha loãng ñược ủ 3 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và ñổi màu ñể ñịnh tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng ñộ pha loãng và dựa vào bảng MPN của Mac Crady ñể suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1 g mẫu ban ñầu.
* Môi trường và hóa chất
- 3 ống nghiệm, mỗi ống có 5ml môi trường Lauryl Triptose broth có nồng ñộ gấp ñôi (LTA).
- 12 ống, mỗi ống có 9ml môi trường trên nồng ñộ bình thường (LTB). Trong các ống nghiệm chứa môi trường LTA và LTB ñều có ống phao (durham) ñặt ngược ở bên trong.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 25 - 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước muối 2%, dung dịch ñệm Phosphate Buffered Saline (PBS) vô trùng.
- 1 pipet 10ml, 10 pipet 1ml
* Các bước tiến hành
- Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc ñồng nhất mẫu. Dùng kéo, kẹp ñã ñược khử trùng cân chính xác 10g tôm và cho vào cối sứ ñã khử trùng
- Dùng chày sứ nghiền nhỏ mẫu, có thể cho thêm 1 - 2 ml dung dịch PBS ñể nghiền.
- Tiếp tục cho dung dịch PBS vào cối sứ, nếu cho theo tỷ lệ 1ml BPS : 1g mẫu ta ñược hệ số pha loãng 10o. Nếu cho theo tỷ lệ 10ml BPS : 1g mẫu ta ñược hệ số pha loãng 10-1.
- Dịch mẫu ñồng nhất ñược tiếp tục pha loãng theo dãy số thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với ñầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho ñồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dùng pipet hút ñảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần. Dung dịch mẫu này có ñộ pha loãng 10-2. Sau ñó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetmen có cùng ñầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tựñể có dịch mẫu với ñộ pha loãng 10-3.
- Dùng pipet 10ml hút 5ml mẫu chưa pha loãng (10o) cho vào một ống môi trường (LTA). Tiến hành tương tự, lặp lại với 3 ống (Hình 2.1). Xoay nhẹ ống trong lòng 2 bàn tay ñể nước và môi trường trộn ñều. Tránh lắc mạnh ñể không khí không lọt vào ống phao. Ghi ký hiệu.
- Dùng pipet 1ml hút 1ml nước chưa pha loãng (10o) cho vào 1 ống LTB. Tiến hành lần lượt với 3 ống. Ghi ký hiệu.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 26 - Lấy 1 pipet khác, hút 1ml nước pha loãng (10-1) cho vào 1 ống LTB. Tiến hành lần lượt với 3 ống. Ghi ký hiệu.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 27
Hình 2. 1. Sơñồ pha loãng mẫu và cấy mẫu vào các loại môi trường
* ðọc kết quả
Tổng sốFecal coliform ñược ñọc ở lô ủ 44,5oC/ 24giờ.
- Quan sát sự hình thành bọt khí trong ống phao (kết quả dương tính). ðiền kết quả vào các cột trong bảng nhật ký.
- ðể khẳng ñịnh lại sự có mặt của Fecal coliform cần tiến hành xác ñịnh sự hình thành Indol trong môi trường Tripton bằng cách nhỏ thuốc thử Kovac vào các ống nghiệm trên. Phản ứng dương tính khi có màu ñỏ xuất hiện trong môi trường trong vòng vài phút.
- Dùng bảng MPN - 3 ống ñể tính lượng Fecal coliform có xác suất lớn nhất trong mẫu.
