3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp phân lập, xác ñị nh tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to t ại Sa Pa Lào Cai và Tam ðảo Vĩnh Phúc.
Việc xác ñịnh tác nhân gây bệnh ñược tiến hành theo quy tắc Koch (1876): với 4 bước
1. Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết. Ví dụ: Triệu chứng héo, ñốm, thối thân rễ... và nhận dạng: màu sắc, kích thước, hình dạng...
2. Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua ñó mô tả và giám ñịnh.
3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khoẻ, quan sát triệu chứng bệnh biểu hiện có giống mô tả ban ñầu
4. Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ cây lây bệnh có xuất hiện triệu chứng bệnh, xác ñịnh xem có giống với tác nhân gây bệnh phân lập từ cây bệnh ban ñầu.
Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm bệnh trong phòng thí nghiệm
ñược tiến hành theo Burgess và cộng sự (2008)
3.3.1.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh chung
a. Phương pháp ñểẩm
- Rửa mẫu bệnh sạch ñất cát dưới vòi nước.
- ðặt mẫu bệnh vào hộp Petri có giấy thấm vô trùng - Sau 1 - 2 ngày quan sát vi sinh vật gây bệnh từ mô bệnh b. Phương pháp phân lập ký sinh gây bệnh trực tiếp từ mẫu cây bệnh
- Rửa mẫu bệnh dưới vòi nước - Lựa chọn các mô bệnh ñiển hình
- Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1 x 1 cm. Miếng cắt phải nằm ở ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, có cả mô bệnh và mô khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 700C trong 15 - 20 giây, sau ñó rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...28
cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm.
- ðặt các mảnh mô cây vào môi trường phân lập bao gồm WA có kháng sinh hoặc môi trường PSM.
- Khi nấm ñã phát triển với kích thước ñường kính tản nấm 1 - 2 cm, cấy truyền sang môi trường thích hợp như: PDA, PCA và môi trường WA (với mục ñích làm thuần nấm).
- Làm thuần mẫu nấm bằng cách cấy ñỉnh sinh trưởng của một sợi nấm từ môi trường WA sang môi trường nuôi cấy PDA và PCAc. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từñất và rễ cây Sì to.
Phương pháp phân lập Phytophthora từ ñất và rễ cây Sì to bằng sử
dụng mồi bẫy: cánh hoa (Drenth và Sendall, 2004).
- Lấy mẫu ñất ở gốc của cây bị bệnh, bao gồm cả rễ cây bệnh
- Cho ñất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi ñạt 3/4 cốc. Khuấy nhẹ ñất trong cốc bàng ñũa thuỷ tinh, ñể ñất lắng xuống khoảng 2h ( tốt nhất ñể qua ñêm)
- Cắt cánh hoa hồng, kích thước khoảng 2 x 2 cm ( 1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên.
- ðể cốc bẫy bào tử qua ñêm ở nhiệt ñộ phòng (20 - 250C)
- Quan sát cánh hoa sau: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày xem có xuất hiện vết hoại tử.
- Làm sạch cánh hoa có vết bệnh, khử trùng bề mặt và tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh nhưñối với mẫu sì to bị bệnh.
2.3.1.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo (theo Burgess và cộng sự (2008) Tiến hành lây bệnh theo 3 phương pháp sau:
- Phương pháp lây bệnh qua ñất với Phytophthora gây thối củ: + Ngâm hạt kê và vỏ trấu (tỉ lệ 1:1 về thể tích) trong nước và ñể qua
ñêm trong tủ lạnh, ñể hỗn hợp ngấm nước + Chắt bỏ phần nước
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...29
+ Cho 150ml giá thể vào một bình tam giác dung tích 250ml
+ Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn ñể nút chặt miệng bình tam giác.
+ Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng
+ ðể bình nguội, sau ñó cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác.
+ Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy ñểñảm bảo nguồn bệnh ñược phân bốñều trong giá thể.
+ Nấm nhân nuôi trong bình tam giác khoảng 15 ngày, lấy ra trộn vào
ñất vào bốn phía của cây.
- Lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký chủ: Nguồn bệnh ñược phân lập từ
mẫu cây bị bệnh, ñược ñặt trực tiếp lên bộ phận của cây.
- Tưới trực tiếp dung dịch nấm bệnh vào xung quanh gốc cây: Sợi nấm
ñược cấy thuần trên ñĩa petri, cho nước cất vào với liều lượng 1% dung dịch
ñặc sợi nấm ñược cạo trên bề mặt sợi nấm trên ñĩa petri, ñể tạo du ñộng bào tử, liều lượng tưới 300ml/cây/lần, tưới 3 lần trong thời gian 3 tuần (Drenth và Guest, 2004)[16].
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu một sốñặc ñiểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo -