2.5.3.1. Phản ứng trung hoà vi rút
Phản ứng này dùng chẩn ựoán các trường hợp bị bệnh nhẹ, không ựiển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh ựể tìm kháng thể. Phản ứng này rất ựặc hiệu, nhạy và nhanh chóng. Việc tìm ra kháng thể ựặc hiệu ở gia súc chưa
ựược tiêm phòng vắc xin LMLM ựủ cơ sởựể kết luận là con vật có bệnh. Kháng nguyên là vi rút LMLM chuẩn nuôi cấy trên môi trường IB-RS- 2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu và gây bệnh tắch tế bào. Kháng thể
nghi là huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh ựược xử lý ở nhiệt ựộ 56ỨC trong 30 phút.
Phản ứng trung hoà vi rút thực hiện trên môi trường tế bào IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu ựược nuôi trong các ựĩa nhựa lỗ nhỏ ựáy bằng. để xác ựịnh týp gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 24
bệnh vào 7 ống nghiệm, sau ựó cho vào mỗi ống nghiệm từng týp vi rút LMLM ựã biết với hiệu giá vi rút ựã ựược xác ựịnh là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương ựương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủấm 370C trong khoảng 1 giờ ựể kháng nguyên và kháng thể tác
ựộng với nhau. Sau ựó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy lỗ
nhựa ựã nuôi cấy tế bào, ựồng thời các lỗ ựối chứng âm không cấy hỗn dịch mà ựể tế bào tiếp tục phát triển và các lỗ ựối chứng dương cấy các týp vi rút LMLM tiếp tục ựể tủấm 370C trong vòng 2-3 ngày.
đọc kết quả, nếu lỗựĩa nhựa nào không có hiện tượng huỷ hoại tế bào, giống với lỗ ựối chứng âm, chứng tỏ lỗ ựó có kháng thể tương ựương với týp vi rút LMLM nên vi rút bị kháng thể trung hoà và không còn khả năng huỷ
hoại tế bào. Ngược lại, nếu lỗựĩa nào có hiện tượng huỷ hoại tế bào, tức là ở ựó vi rút vẫn còn khả năng gây bệnh, giống lỗ ựối chứng dương, chứng tỏ
kháng thể không tương ứng với týp vi rút ựó hoặc trong huyết thanh không có kháng thể.
Sau khi ựã ựịnh týp vi rút gây bệnh, người ta pha loãng huyết thanh nghi theo cơ số 2, tức ở các nồng ựộ 1/2, 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128Ầ Lấy từng ựộ pha loãng huyết thanh này trộn với týp vi rút ựã biết một lượng tương
ựương, ựể tủấm 370C trong 1 giờ. Sau ựó lấy hỗn dịch của từng ựộ pha loãng cho vào các dãy lỗựĩa nhựa ựã nuôi cấy tế bào, cần có các lỗựối chứng âm và dương ựể so sánh, ựể tủấm 370C trong 2 -3 ngày và ựem ra ựọc kết quả hiệu giá kháng thể tương ứng với ựộ pha loãng lớn nhất mà ởựó tế bào nuôi không bị huỷ hoại.
2.5.3.2. Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test)
Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thông thường ựược dùng ựể phát hiện bệnh LMLM, vì ựơn giản, cho kết quả nhanh, chắnh xác và ắt tốn kém. Nguyên lý: Dùng các sero-týp huyết thanh ựã biết ựể phát hiện týp vi rút gây
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 25
bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001) [14]. Phản ứng kết hợp bổ thể ựược thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự
tham gia của bổ thể.
Huyết thanh miễn dịch (huyết thanh chuẩn) của từng sero-týp ựược chế
trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch. Kháng nguyên nghi là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường phù hợp, sau ựó lấy dịch ựể làm phản ứng.
Phản ứng kết hợp bổ thể cũng ựã ựược sử dụng ựể chẩn ựoán phân biệt giữa vi rút LMLM và các vi rút gây viêm miệng mụn nước khác. Tuy vậy một số tác giả cho rằng, dùng phản ứng kết hợp bổ thể ựể phân biệt các týp với nhau kém hiệu quả.
2.5.3.3. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Theo tác giả Tô Long Thành, ELISA là một phản ứng dùng ựể chẩn
ựoán nhanh bệnh LMLM và ựể giám ựịnh týp huyết thanh của vi rút. Phản
ứng này có những thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thông thường khác. (Tô Long Thành, 2000) [22]. đây là một phản ứng có ựộ ựặc hiệu cao khi dùng với một kháng thểựơn dòng, phản ứng cũng có ựộ nhạy cao trong chẩn ựoán và ựịnh týp vi rút (Have P., 1987) [40]; (Hamblin C.,và cộng sự, 1987) [39]. Phản ứng ELISA cũng thường ựược sử dụng hơn so với phản ứng kết hợp bổ
thể vì nó có ựộựặc hiệu và ựộ nhạy cao hơn, không bịảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể (Nguyễn đăng Khải và cs, 2000)[11].
Nguyên lý: Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym, rồi cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, sau ựó cho cơ chất vào, cơ
chất bị enzym phân huỷ tạo màu và khi so màu trong quang phổ kế sẽ ựịnh lượng ựược mức ựộ phản ứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26
* Phản ứng ELISA trực tiếp dùng ựể phát hiện kháng nguyên
Bước 1: Cố ựịnh kháng thể ựặc hiệu lên phiến chất dẻo, rửa nước ựể
loại bỏ kháng thể không gắn.
Bước 2: Cho huyễn dịch bệnh phẩm ựã chiết xuất hoà tan (kháng nguyên) lên. Nếu có kháng nguyên tương ứng, chúng sẽ gắn với kháng thể ựặc hiệu, rửa nước ựể loại bỏ kháng thể thừa.
Bước 3: Cho kháng thể ựã gắn enzym vào. Nếu ở bước 2 ựã có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thểựặc hiệu, thì ở bước 3 này sẽ xảy ra kết hợp lần thứ hai của kháng nguyên với kháng thể ựánh dấu enzym, rửa nước loại bỏ
kháng thểựánh dấu thừa.
Bước 4: Tiếp tục cho cơ chất tương ứng với enzym vào.
đánh giá kết quả:
- Có màu tức là có kháng nguyên tương ứng, kết luận phản ứng dương tắnh.
- Không có màu tức là kháng nguyên không tương ứng, cho nên kháng nguyên bị rửa trôi từ bước 2, do ựó không có sự kết hợp: kháng thể-kháng nguyên-kháng kháng thể, kết luận phản ứng âm tắnh.
* Phản ứng ELISA gián tiếp dùng ựể phát hiện kháng thể
Bước 1: Gắn kháng nguyên ựã biết lên phiến chất dẻo, rửa nước ựể loại bỏ kháng nguyên thừa.
Bước 2: đưa huyết thanh cần chẩn ựoán lên. Nếu có kháng thể tương
ứng với kháng nguyên chuẩn thì sẽ có kết hợp kháng nguyên-kháng thể, rửa nước loại bỏ kháng thể thừa.
Bước 3: Cho kháng kháng thể tương ứng ựã gắn enzym vào. Nếu ựã có kết hợp kháng nguyên-kháng thể ở bước 2 thì sẽ tiếp tục có kết hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể gắn enzym và khi rửa nước không bị trôi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27
Bước 4: Cho cơ chất tương ứng với enzym vào.
đánh giá kết quả:
Nếu enzym phân huỷ cơ chất tạo màu là phản ứng dương tắnh, huyết thanh nghi có kháng thể tương ứng.
Trong trường hợp huyết thanh không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên, sẽ không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể ở bước 2, khi cho kháng kháng thể vào sẽ không có kết hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng kháng thể, khi rửa nước kháng kháng thể (gắn enzym) bị trôi và cho cơ chất và thì không có enzym phân huỷ, nên không có màu, phản ứng âm tắnh.
Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn ựoán thường sử dụng phản ứng 3ABC-ELISA ựể chẩn ựoán phân biệt huyết thanh dương tắnh là do nhiễm vi rút thực ựịa hay do vắc xin. Cơ sở khoa học của phương pháp này là khi vi rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc móng guốc chẵn, quá trình nhân lên của vi rút sẽ diễn ra. Trong quá trình này, vi rút vừa tạo ra các thành phần ựể tái tạo các hạt vi rút mới (các virion), vừa tạo ra các thành phần không tham gia tạo thành các hạt virion mới mà chỉ ựóng vai trò là các men giúp cho quá trình nhân lên của vi rút. Các thành phần kết hợp thành bản thân vi rút có tắnh kháng nguyên gọi là prô-tê-in cấu trúc (structure protein). Các thành phần không tham gia kết hợp thành virion mới và có tắnh kháng nguyên gọi là prô- tê-in không cấu trúc (non-structure protein).
Trong các prô-tê-in không cấu trúc của vi rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tắnh kháng nguyên rất cao, nó kắch thắch cơ thể gia súc tạo ra kháng thểựặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do ựó việc phát hiện kháng thể ựặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc ựã bị nhiễm vi rút LMLM (Nguyễn Tùng, 2003)[16].
Tuy nhiên, trong các loại vắc xin vô hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên không cấu trúc ựã ựược loại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28
bỏ (gọi là vắc xin tinh khiết). Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kắch thắch cơ thể
sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi rút) chứ không có kháng thể chống lại kháng nguyên không cấu trúc 3ABC.
Một số loại xắc xin khác (vắ dụ: vắc xin ựơn týp O và hai týp O-Asia1 của Trung Quốc) là vắc xin không tinh khiết, do ựó, dùng phản ứng 3ABC- ELISA sẽ không xác ựịnh chắc chắn gia súc nhiễm vi rút LMLM thực ựịa hay do tiêm vắc xin không tinh khiết. Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vắc xin Trung Quốc phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hòa vi rút và ựiều tra lịch sử tiêm phòng vắc xin (Tô Long Thành, 2000)[23].