Tất cả các mẫu huyết thanh ựược xét nghiệm lần ựầu bằng phản ứng 3ABC - ELISA ựể xác ựịnh kháng thể sinh ra do nhiễm vi rút thực ựịa (ựể
phân biệt ựược kháng thể do nhiễm tự nhiên hay do tiêm phòng vắc xin). Tất cả các mẫu dương tắnh với phản ứng 3ABC - ELISA sẽ ựược xét
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40
nghiệm tiếp bằng phản ứng Liquid Phase Blocking ELISA (LPB-ELISA) ựể
xác ựịnh týp huyết thanh. Các týp huyết thanh lưu hành tại Việt Nam gồm có týp O, A, Asia1. Do vậy, phản ứng LPB-ELISA sẽ ựồng thời xét nghiệm kháng thể kháng các týp O, A và Asia1.
3.4.3.1. Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng 3ABC - ELISA
* Nguyên liệu: Bộ KIT chẩn ựoán CHEKIT-FMD-3ABC-ELISA và các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thắ nghiệm.
* Các bước tiến hành xét nghiệm
- đĩa ELISA ựược phủ kháng nguyên 3ABC của vi rút LMLM, kháng nguyên có ựộ tinh khiết cao ựược sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp.
- Pha loãng huyết thanh với tỷ lệ 1: 100.
+ Mẫu huyết thanh trâu, bò, lợn nái cần chẩn ựoán, huyết thanh ựối chứng dương, huyết thanh ựối chứng âm chuẩn ựược pha loãng theo tỷ lệ
1/100 bằng dung dịch CHEKIT-FMD-3ABC-Sample-Diluent. + Cho 100 ộl/giếng vào 96 giếng theo sơựồở trang 41.
+ Ủ ở 370C trong 60 phút. Phức hợp kháng nguyên 3ABC - kháng thể
kháng 3ABC sẽ ựược tạo thành nếu trong huyết thanh có kháng thể kháng 3ABC. Rửa bằng dung dịch CHEKIT-Washing với lượng 300 ộl/ giếng, rửa 3 lần ựể loại bỏ phần kháng thể 3ABC thừa.
- Gắn Conjugate, tỷ lệ 1: 200.
+ 55 ộl CHEKIT-Anti-IgG-PO-Conjugate + 11 ml CHEKIT-Washing & Dilution - Solution.
+ Cho 100 ộl/ giếng, ủ ở 370C trong 60 phút, sau ựó rửa 3 lần thấm khô. - Cho cơ chất: Cho 100 ộl CHEKIT- Chromogen, ủ ở nhiệt ựộ phòng 20-30 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41 Sơựồ xét nghiệm + + + + + + + + + + + + A N N 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 B P P 8 8 ... ... ... ... ... ... ... ... C 1 1 ... ... D 2 2 ... ... E 3 3 ... ... F 4 4 ... ... G 5 5 45 45 H 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(+) = kháng nguyên; N = ựối chứng âm; P = ựối chứng dương; Số: 1, 2 ....46: mẫu huyết thanh xét nghiệm.
- Dừng phản ứng: Cho 50 ộl Stopping-Slution/giếng ựể nhiệt ựộ phòng. - đọc kết quả phản ứng bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm. - đánh giá kết quả theo công thức:
ODsaple-ODneg
Giá trị%(% OD)=
ODpos- ODneg
x 100
Trong ựó ODsample = của mẫu xét nghiệm.
ODpos = ựối chứng (+).
ODneg = ựối chứng (-).
Mẫu dương tắnh khi OD > 30%, mẫu âm tắnh khi OD < 20%, mẫu nghi ngờ khi 20% < OD < 30%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42
3.4.3.2 Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng LPB ELISA
* Nguyên liệu phản ứng gồm có kháng thể bẫy (trapping antibodies); kháng thể phát hiện (detecting antibodies); kháng nguyên; conjugate (kháng huyết thanh thỏ kháng chuột lang ựược cộng hợp với en-zim Horseradish peroxidase, conjugate ựược block với huyết thanh bò không có miễn dịch theo tỷ lệ 50% v/v); substrate (H2O2); chất phát màu (chromogen): OPD - Ortho Phenylenediamine; dung dịch ngừng phản ứng: H2SO4 1,25 M; dung dịch
ựệm ựể gắn kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM (coating buffer): Dung dịch ựệm các-bon-nát/bi-các-bon-nát pH: 9,5; dung dịch ựệm pha loãng huyết thanh và kháng nguyên (PBST): dung dịch ựệm PBS 0,01M bổ sung 0,5% Tween 20 và phenol red 1%, pH=7,4-7,6; dung dịch ựệm block pha kháng huyết thanh chuột lang và conjugate: dung dịch PBST bổ sung 5% sữa tách bơ (skimmed milk), pH=7,4-7,6; dung dịch rửa: dung dịch ựệm PBS 0,002M, pH = 7,4-7,6; dung dịch ựệm Citrate acetate 1M, pH=5,6 ựể pha dung dịch phát màu; ựĩa ELISA; ựĩa nhựa ựáy chữ U 96 lỗ.
* Các bước tiến hành
- Gắn ựĩa: Kháng huyết thanh thỏ ựược pha loãng bằng dung dịch gắn với tỷ lệ 1/1000. Nhỏ vào mỗi lỗ trong ựĩa 96 lỗ 50 ộl kháng huyết thanh thỏ ựã pha loãng. đậy nắp và ựể qua ựêm ở nhiệt ựộ 40C (hoặc ở 370C trong 1h)
- Pha lỏng (liquid phase): ựây thực chất là pha trung hòa huyết thanh + Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra theo cơ số 2 trên ựĩa 96 lỗ ựáy chữ U, bắt ựầu từựộ pha loãng 1/16 ựến 1/256. Mỗi lỗ 50 ộl.
+ Pha loãng kháng nguyên vi rút LMLM (theo nồng ựộ tối ưu ựã biết hoặc ựã chuẩn ựộ trước khi làm LPB- ELISA). Nhỏ 50 ộl kháng nguyên ựã pha loãng vào tất cả các lỗ của ựĩa chữ U. đậy nắp ựĩa, ựểở nhiệt ựộ 40C qua
ựêm; trong mỗi ựĩa ựều có ựối chứng dương tắnh mạnh, ựối chứng dương tắnh yếu, ựối chứng âm tắnh và ựối chứng kháng nguyên Ca (không có huyết
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43
thanh, chỉ có kháng nguyên và PBST).
+ Chuyển hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên tới ựĩa ELISA: rửa ựĩa phản ứng ELISA 3 lần bằng dung dịch rửa. Sau khi rửa ựĩa, chuyển 50 ộl hỗn hợp huyết thanh/kháng nguyên từ ựĩa ựáy chữ U sang ựĩa ELISA theo vị trắ tương ứng.
+ Nhỏ kháng thể phát hiện: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ của ựĩa ELISA 50 ộl kháng huyết thanh chuột lang kháng vi rút LMLM ựã ựược pha loãng với tỷ lệ 1/100 bằng PBST bổ sung sữa tách bơ. đậy ựĩa, ủ ở nhiệt ựộ
370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
+ Nhỏ conjugate: Rửa ựĩa 3 lần, nhỏ vào mỗi lỗ 50 ộl conjugate ựã pha loãng 1/200. đậy ựĩa, ủở nhiệt ựộ 370C trong 1 giờ, lắc liên tục.
+ Thêm Substrate/chromogen: Rửa ựĩa 3 lần, chuẩn bị dung dịch Substrate/chromogen (dung dịch OPD trong citrate acetate buffer bổ sung 0,5% H2O2), nhỏ vào mỗi lỗ 50 ộl, ựể phản ứng xảy ra trong 20-30 phút ở chỗ
tối tại nhiệt ựộ phòng (nếu ựể quá lâu hoặc ựể ra chỗ có ánh sáng màu sẽ xuất hiện nhanh và làm sai lệch kết quả).
+ Ngừng phản ứng: Nhỏ vào mỗi lỗ 50 ộl dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 1,25M.
+ đọc kết quả: Sử dụng máy ựọc ELISA (photo meter, Lab system Multiscan Plus II) ở bước sóng 492 nm.
- Tắnh kết quả: Từ kết quảựọc ựược ở máy ta có ựậm ựộ quang học OD (optical density) của mẫu huyết thanh. Từ OD ta tắnh ựược phần trăm ức chế
của mẫu PI (percentage inhibition). Dựa vào PI ựể ựánh giá kết quả. Mẫu huyết thanh nào có PI ≥ 50 ựược coi là dương tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44
Công thức tắnh PI như sau:
(OD mẫu huyết thanh kiểm tra x 100)
PI = 100 -
(OD trung bình kháng nguyên ựối chứng)