Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống invitro cần phải chọn cẩn thận các cây mẹ (cây cho mẫu nuôi cấy), các cây này cần phải sạch bệnh: ñặc biệt là bệnh vius.
Chọn cây mẹ ñể lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao, các cây này ở trạng thái sinh trưởng mạnh. Chọn cơ quan ñể lấy mẫu thường là chồi non, ñoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non v.v…
Vì vậy việc tuyển chọn trồng cây mẹ trong ñiều kiện môi trường sạch, chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh thích hợp thì khi lấy mẫu sẽ giảm ñược tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy
Bước 1: Nuôi cấy khởi ñộng
ðây là giai ñoạn khử trùng mẫu ñưa vào nuôi cấy. Giai ñoạn này cần ñảm bảo các yêu cầu:
- Tỷ lệ nhiễm thấp - Tỷ lệ sống cao
- Tốc ñộ sinh trưởng nhanh
Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của cây, thường chọn mô non (ít chuyên hoá - ñỉnh chồi, mầm ngủ, lá non vẩy củ….)
Xác ñịnh chế ñộ khử trùng mẫu thích hợp, thường dùng các hoá chất HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% trong 15-20 phút hoặc H2O2, nước brom… Chọn ñúng phương pháp khử trùng sẽ ñưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ ñạt ñược tốc ñộ sinh trưởng nhanh.
Bước 2: Nhân nhanh
Là giai ñoạn khích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua việc hoạt hoá chối nách và tạo chồi bất ñịnh và tạo phôi vô tính
Yêu cầu: Xác ñịnh ñược môi trường nuôi cấy và ñiều kiện ngoại cảnh thích hợp ñể có hệ số nhân cao nhất. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều cytokinin thì có khả năng tạo chồi nhiều. Chế ñộ buồng nuôi cấy thường là 25-27oC với 16h chiếu sáng/ ngày, cường ñộ chiếu sáng từ 2000-4000 lux. Tuy nhiên ñối với mỗi loại ñối tượng nuôi cấy ñòi hỏi chế ñộ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phalennopsis ở giai ñoạn ñầu cần che tối...
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Là bước tạo rễ cho chồi ñể có cây hoàn chỉnh. Các chồi ñược hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần cấy chuyển qua môi trường khác ñể kích thích tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường ñược bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu Axin sang môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng khác.
ðối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất ñiều tiết sinh trưởng hoặc môi trường chứa Cytokinin nồng ñộ thấp thì phôi phát triển cây hoàn chỉnh.
Bước 4: Ra cây ngoài ñiều kiện tự nhiên
Là giai ñoạn ñưa cây từ trong ống nghiệm ra trồng ngoài ñiều kiện tự nhiên. ðối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ ra ñất, nhưng ña số chỉ sau khi chồi ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh thì mới chuyển ra ngoài vườn ươm.
ðể ñưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao và sinh trưởng tốt cần ñảm bảo yêu cầu: Cây trong ống nghiệm ñã ñạt những tiêu chuẩn hình thái nhất ñịnh (số lá, số rễ, chiều cao...)
Quá trình thích nghi với ñiều kiện bên ngoài của cây cần ñược chăm sóc ñặc biệt. Vì cây chuyển từ môi trường bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những ñiều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải ñáp ứng các yêu cầu:
Cây ñược che phủ bằng nilon, tưới phun sương ñảm bảo cung cấp ñộ ẩm và làm mái
Có giá thể trồng cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Giá thể trồng cây có thể là ñất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa ñất, mùn cưa và bọt biển.
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải ñược chăm sóc và bảo vệ truớc những yếu tố bất lợi sau:
Mất nước nhanh làm cây bị héo khô
Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn. Cháy lá do nắng