3.4.3.1. Phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo
- Chuẩn bị cõy lỳa: Ngõm hạt lỳa giống nảy mầm, ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống hai hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú ủặt cỏc khay nhỏ cú lỳa, mỗi khay lỳa cú nước vào bể và chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo ủược khoảng 20 - 22 ngày (lỳc ủú lỳa cú 3 - 4 lỏ) thỡ phun dung dịch bào tửủể lõy bệnh.
- Chuẩn bị nguồn bào tửủể lõy bệnh: Nguồn nấm ủược lấy từống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar, mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi
ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủ ủịnh ụn 26- 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, rồi lại dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiờng ủĩa quột khụ mặt thạch (Mỗi mẫu phõn lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sụi).
Cỏc ủĩa ủó rửa xong ủược ủặt trong tủ 12 giờ sỏng, 12 giờ tối, chỉ sau 3 ngày bào tửủó hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng cú pha Tween 20 với nồng
ủộ 1/10.000 ủể rửa và lọc bào tử (20 ml nước ủể rửa bào tử cho một ủĩa petri). Lấy một dung dịch bào tửủó ủược lọc ở mỗi mẫu phõn lập nhỏ lờn lam và ủặt lờn soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch ủể cú khoảng 30 - 50 bào tử trờn một quang trường, tương ủương với 105 bào tử/ 1ml.
- Lõy nhiễm: Dựng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0,5l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay
ủó ủược lõy nhiễm vào trong tủ lõy nhiễm. Phun mự giữ ẩm liờn tục trong vũng 20 giờ (ẩm ủộ > 90%). Sau khoảng thời gian ủú ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra ngoài nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạủồng thời tưới nước ủầy ủủ cho lỳa ủể
lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển.
- ðỏnh giỏ: Sau 7 ngày lõy nhiễm tiến hành ủỏnh giỏ phản ứng của cỏc giống lỳa theo thang phõn cấp của Kato,1993 [62]
Cấp 0: Khụng cú vết bệnh, khỏng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ủầu kim, khỏng (R)
Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nõu nhạt ủến nõu tối, khỏng (R)
Cấp 3: Vết bệnh to hơn cú màu xỏm ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh ủiển hỡnh (hỡnh thoi màu xỏm ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0, 1, 2: khỏng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
3.4.3.2. Phương phỏp xỏc ủịnh chủng sinh lý (Race) của cỏc mẫu phõn lập
nấm Pyricularia oryzae Cav.
- ðỏnh giỏ phản ứng khỏng bệnh của 12 giống lỳa chỉ thị của Nhật Bản với cỏc mẫu phõn lập nấm pyricularia oryzae Cav. bằng phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo. Mỗi giống lỳa này ủều cú gen khỏng bệnh ủạo ụn khỏc nhau
ủó ủược xỏc ủịnh và ủược mó hoỏ bằng cỏc chữ số.
- Từ kết quả phản ứng của 12 giống lỳa với cỏc mẫu phõn lập nấm
pyricularia oryzae Cav. (isolate), dựa vào mó số của cỏc giống và phản ứng
khỏng, nhiễm bệnh của chỳng ủể xỏc ủịnh cỏc chủng sinh lý (race) của nấm
pyricularia oryzae Cav. Bằng cỏch cộng tất cả cỏc mó số của cỏc giống lỳa cú
phản ứng nhiễm bệnh lại với nhau theo thứ tự hàng thập phõn, hàng ủơn vị, hàng chục và hàng trăm.
3.5. Cụng thức tớnh toỏn số liệu - Tỷ lệ bệnh:[34]