3.4.1. Phương phỏp nghiờn cứu ngoài ủồng ruộng
3.4.1.1. Phương phỏp ủiều tra ngoài ủồng ruộng
- Ruộng ủiều tra: trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, cỏnh
ủồng khỏc nhau chọn 3 ruộng ủại diện ủểủiều tra.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng, ụ thớ nghiệm ủiều tra theo 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị
bệnh ủể tớnh chỉ số và tỉ lệ bệnh.
- Thời gian ủiều tra: ðiều tra vào cỏc giai ủoạn sinh trưởng sau + Giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh
+ Giai ủoạn lỳa ủứng cỏi + Giai ủoạn lỳa ủũng non, + Giai ủoạn trước trỗ
+ Giai ủoạn chớn sỏp (sau trỗ 20 ngày). * ðiều tra diễn biến bệnh
- Ruộng ủiều tra: Trờn giống lỳa Q5 chọn 3 ruộng ủại diện.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng, mỗi ụ thớ nghiệm ủiều tra 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh, phõn cấp lỏ, bụng bị
bệnh rồi tớnh tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh.
- Thời gian ủiều tra: Theo quy ủịnh của ngành 7 ngày/1 lần.
3.4.1.2. Phõn cấp bệnh ủạo ụn
Cấp 0: Khụng cú cấp bệnh trờn lỏ.
Cấp 1: Cỏc vết bệnh màu nõu, nhỏ như mũi kim, khụng cú vựng sinh bào tử.
Cấp 2: Vết bệnh nhỏ, trũn hoặc hỡnh thoi dài, ủường kớnh 1 - 2 mm, cú viền nõu rừ rệt, hầu hết cỏc lỏ dưới ủều cú vết bệnh. Cấp 3: Vết bệnh tương tự như cấp 2, nhưng cỏc lỏ phớa trờn cũng bị bệnh. Cấp 4: Vết bệnh cú dạng hỡnh thoi ủiển hỡnh, dài từ 3 mm trở lờn, diện tớch bị bệnh ở cỏc lỏ dưới nhỏ hơn 4% diện tớch lỏ. Cấp 5: Vết bệnh ủiển hỡnh, cỏc vết bệnh cú thể liờn kết với nhau, diện tớch vết bệnh từ 4-10% diện tớch lỏ. Cấp 6: Diện tớch vết bệnh từ 10 - 25% diện tớch lỏ. Cấp 7: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 26 - 50% diện tớch lỏ. Cấp 8: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 51 - 75% diện tớch lỏ. Cấp 9: Diện tớch vết bệnh chiếm trờn 75% diện tớch lỏ. * Phõn cấp bệnh trờn bụng Cấp 0: Khụng cú vết bệnh trờn bụng. Cấp 3: Vết bệnh trờn một vài giộ sơ cấp hoặc phần giữa của trục bụng. Cấp 5: Vết bệnh bao quanh một phần gốc bụng (ủốt) hoặc phần ống rạ phớa dưới của trục bụng.
Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bụng hoặc một phần trục bụng gần cổ bụng, trờn bụng cú 30% số hạt chắc trở lờn.
3.4.1.3. Thớ nghiệm ảnh hưởng của liều lượng và phương phỏp bún phõn ủạm
ủến mức ủộ phỏt sinh phỏt triển của bệnh ðạo ụn vụ xuõn 2010
- Thớ nghiệm liều lượng ủạm: Thớ nghiệm ủược bố trớ 5 cụng thức, nhắc lại 3 lần, bố trớ theo phương phỏp khối ngẫu nhiờn ủầy ủủ. Thớ nghiệm ủược bố trớ trờn giống Q5 với cỏc cụng thức: CT I: 60 kg N/ha. CT II: 80 kg N/ha. CT III: 100 kg N/ha; CT IV: 120 kg N/ha; CT V: 140 kg N/ha; + Giống: Q5. + Ngày cấy: 10/2/2010. Mật ủộ: 45 khúm/m2; 2-3 dảnh/khúm. + Nền phõn bún: Phõn chuồng: 3.000 kg/ha; Phõn lõn Văn ðiển: 60 kg P2O5/ha; Kalichlorua: 60 kg K2O kg/ha.
+ Phương phỏp bún:
Bún lút 100% phõn chuồng + 100% lõn + 30% ủạm.
Bún thức lần 1 (sau cấy 15 ngày): 70% ủạm + 30% Kalichlorua. Bún thỳc lần 2 (sau cấy 40 ngày): 70% Kalichlorua cũn lại.
- Thớ nghiệm phương phỏp bún ủạm: Thớ nghiệm ủược bố trớ 4 cụng thức, nhắc lại 3 lần, bố trớ theo phương phỏp khối ngẫu nhiờn ủầy ủủ. Lượng
ủạm bún thớ nghiệm là 80 kgN/ha. Cỏc yếu tố phi thớ nghiệm tương tự như thớ nghiệm về liều lượng ủạm. Cụng thức:
CT I: Bún lút (70%) + Bún thỳc lần 1 (30%) CT II: Bún lút (50%) + Bún thỳc lần 1 (50%)
CT III: Bún thỳc lần 1 (50%) + Bún thỳc lần 2 (50%) CT IV: Bún thỳc lần 1 (30%) + Bún thỳc lần 2 (70%)
3.4.1.4. Khảo sỏt hiệu lực của thuốc hoỏ học ủối với bệnh ủạo ụn * Khảo sỏt hiệu lực phũng trừ của thuốc Bump 650WP ở cỏc nồng ủộ khỏc nhau ủối với bệnh ủạo ụn lỏ. - Thớ nghiệm ủược tiến hành với 4 cụng thức: + Cụng thức 1: Bump 650WP nồng ủộ 0,10% (0,42 kg/ha) + Cụng thức 2: Bump 650WP nồng ủộ 0,15% (0,75 kg/ha) + Cụng thức 3: Bump 650WP nồng ủộ 0,20% (1,00 kg/ha) + ðối chứng: Khụng phun thuốc - Diện tớch ụ thớ nghiệm: Mỗi ụ thớ nghiệm cú diện tớch là 50 m2, nhắc lại 3 lần và ủược bố trớ theo khối ngẫu nhiờn hoàn chỉnh (RCB).
- Dụng cụ: Dựng bỡnh bơm tay ủeo vai phun với lượng nước thuốc là 500 lớt/ ha. - Thời ủiểm phun thuốc: Phun khi ruộng cú tỉ lệ khoảng 5% (ủối với bệnh ủạo ụn lỏ).
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ bị bệnh và phõn cấp lỏ bệnh.
- Thời ủiểm ủiều tra: Trước khi phun thuốc và sau khi phun thuốc 5, 10, 15, 20 ngày.
- Cụng thức tớnh toỏn: Hiệu lực của thuốc ủược tớnh theo cụng thức Henderson – Tilton.
* So sỏnh hiệu lực phũng trừ ủối với bệnh ủạo ụn lỏ của 2 loại thuốc: Bump 650WP và Fuji-one 40WP.
- Thớ nghiệm ủược tiến hành với cỏc cụng thức sau: + Cụng thức 1: Bump 650WP (0,75 kg/ha)
+ Cụng thức 2: Fuji-one 40WP (1,00 kg/ha) + ðối chứng : Khụng phun thuốc
- Diện tớch ụ thớ nghiệm, dụng cụ, thời ủiểm phun thuốc, chỉ tiờu ủiều tra, thời ủiểm ủiều tra và cụng thức tớnh toỏn thực hiện tương tự như thớ nghiệm khảo sỏt hiệu lực phũng trừ của thuốc Bump 650WP với cỏc nồng ủộ khỏc nhau ở trờn.
3.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng
3.4.2.1. Phương phỏp phõn lập nấm theo phương phỏp ủơn bào tử
- ðối với mẫu lỏ bệnh ủó bảo quản khụ ủem rửa sạch bằng nước mỏy sau ủú rửa bằng nước cất, cắt một ủoạn lỏ cú vết bệnh ủặt trong ủĩa petri cú giấy lọc ẩm, ủậy nắp, ủể ủĩa ở nhiệt ủộ 26 - 280C khoảng 1 - 2 ngày ủể cho nấm bệnh mọc.
- ðối với mẫu tươi thỡ tiến hành phõn lập ngay với cỏc bước tiếp theo: + Lấy ủĩa WA (Water agar), cầm ỳp mặt thạch, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ
bụng cú vết bệnh theo hỡnh tam giỏc, dựng panh cặp và ủặt cho bào tử ở vết bệnh dớnh vào bề mặt thạch, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi
ủưa lờn kớnh hiển vi dễ quan sỏt bào tử.
+ Dựng panh lấy một ớt bụng thấm nước, nhỳng vào cồn 96% rồi khử trựng kim thuỷ tinh.
+ ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiển vi, quan sỏt và nhẹ nhàng lấy bào tử vào ủầu kim thuỷ tinh (ủiều chỉnh kớnh và kim thuỷ tinh sao cho mỗi lần khờu lấy chớnh xỏc một bào tử nấm). Vặn cho vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4 khoanh ở bốn gúc của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thuỷ tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn một bào tử (mỗi
ủĩa PSA thả 4 bào tử)
+ ðậy nắp ủĩa lại và ủặt vào tủ ủịnh ụn cú nhiệt ủộ ổn ủịnh 260C- 280C. Sau 3- 4 ngày bào tử phỏt triển thành tản nấm, dựng que cấy nấm (ủó ủược vụ
trựng) lấy một mẩu thạch cú sợi nấm non cấy vào ống nghiệm cú mụi trường PSA nghiờng ủể giữ nguồn dựng nghiờn cứu.
3.4.2.2. Phương phỏp nghiờn cứu khả năng phỏt triển của nấm pyricularia
oryzae Cav. trờn cỏc mụi trường nhõn tạo
* Chuẩn bị mụi trường nghiờn cứu. Chuẩn bị 5 loại mụi trường: PSA, cỏm Agar, Bột gạo Agar, PGA và OMA.
Bước 1: Chuẩn bịủĩa petri
Rửa sạch bằng nước mỏy sau ủú khử trựng khụ ở 160o C trong 3 giờ.
Bước 2: Nấu mụi trường
+ Mụi trường PSA: Dựng 1kg khoai tõy ủõy ủó gọt sạch vỏ, cắt thành từng lỏt mỏng + 1 lớt nước ủun sụi 30 phỳt sau ủú dựng lớp vải màn kộp ủể lọc ta ủược nước khoai tõy (PB: Potato Broth). Lấy 200ml PB ủun sụi, cho vào ủú 20g ủường
ăn + 20g agar, ủổ thờm nước cất cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường PGA: làm tương tự như PSA nhưng thay ủường ăn (Sacaroza) bằng ủường ủơn glucoza.
+ Mụi trường OMA: Cho 50g bột mạch + 500ml nước cất khụng ion vào trong xoong và quấy ủều. Sau ủú ủặt lờn bếp ủun nhỏ lửa và cho thờm 20g ủường
ăn vào xoong và quấy ủều. Pha 20g agar vào trong 200ml nước cất khụng ion và lắc ủều rồi ủổ dung dịch này vào xoong dung dịch ủang ủun nờu trờn và quấy ủều. Cho thờm 300ml nước cất khụng ion vào xoong cho ủủ 1lớt mụi trường.
+ Mụi trường cỏm agar: Cho 20g cỏm vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
ủường ăn + 20g agar và bổ sung thờm nước cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường bột gạo agar: Cho 20g bột gạo vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
Bước 3: Hấp khử trựng mụi trường.
ðổ mụi trường vào bỡnh tam giỏc (333ml/ 500ml), ủậy lại bằng giấy bạc rồi
ủem hấp ở 121oC trong 20 phỳt, sau khi hấp xong, ủể mụi trường nguội dần ủến khoảng 600C thỡ thờm 0,1% Neomycin vào lắc ủều.
Bước 4: ðổ mụi trường vào ủĩa Petri ủó vụ trựng, ủể nguội sau ủú cấy nấm.
* Chuẩn bị nguồn nấm:
- Dựng que cấy lấy nấm từống nguồn, cấy vào ủĩa petri mụi trường PSA (cấy một ủiểm chớnh giữa trờn ủĩa) sau 4- 6 ngày nấm mọc thành tản nấm và dựng
ủú làm ủĩa nguồn ủể cấy nấm.
- Cấy nấm: Từ nguồn nấm pyricularia oryzae Cav. thuần ủó mọc ở trờn
ủĩa PSA, dựng ủột trũn cú ủường kớnh 5 mm ủột nấm ở ủĩa nguồn theo ủường trũn ủồng tõm. Dựng que cấy nấm lấy từng khoanh cấy trờn 4 loại mụi trường
ủó chuẩn bị, mỗi ủĩa cấy một khoanh ở chớnh giữa, mỗi loại mụi trường, mỗi chủng phõn lập cấy 3 ủĩa (3 lần nhắc lại).
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
+ ðo ủường kớnh của tản nấm sau khi cấy nấm tại cỏc thời ủiểm sau cấy 2, 4, 6, 8, 10 ngày. ðo giỏn tiếp ở phớa ngoài của hộp, khụng mở nắp hộp, mỗi ủĩa ủo 2 lần theo hỡnh dấu +.
+ Xỏc ủịnh số lượng bào tử ủược hỡnh thành sau khi cấy 14 ngày, rửa sợi nấm, ủặt ủĩa nấm trong tủ 12 giờ sỏng 12 giờ tối trong 3 ngày ủể nấm sinh bào tử. Dựng 20ml Tween 20 với nồng ủộ 1/10.000 rửa bào tử. Lấy 0,1 ml nước tween 20 cú bào tử cho lờn lam kớnh, ủậy lamen lại sau ủú ủưa vào vựng ủếm và ủặt lờn kớnh hiển vi quang học 10X , ủếm bào tử của 5 quang trường. Từủú tớnh số bào tử cú trong 1 ml rồi tớnh số bào tử nấm/cm2 mặt mụi
trường nuụi cấy ủể so sỏnh sự hỡnh thành bảo tử của cỏc chủng sinh lý nấm
pyricularia oryzae Cav.
3.4.3. Phương phỏp nghiờn cứu trong nhà lưới
3.4.3.1. Phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo
- Chuẩn bị cõy lỳa: Ngõm hạt lỳa giống nảy mầm, ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống hai hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú ủặt cỏc khay nhỏ cú lỳa, mỗi khay lỳa cú nước vào bể và chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo ủược khoảng 20 - 22 ngày (lỳc ủú lỳa cú 3 - 4 lỏ) thỡ phun dung dịch bào tửủể lõy bệnh.
- Chuẩn bị nguồn bào tửủể lõy bệnh: Nguồn nấm ủược lấy từống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar, mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi
ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủ ủịnh ụn 26- 280C trong 2 tuần. Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, rồi lại dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiờng ủĩa quột khụ mặt thạch (Mỗi mẫu phõn lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sụi).
Cỏc ủĩa ủó rửa xong ủược ủặt trong tủ 12 giờ sỏng, 12 giờ tối, chỉ sau 3 ngày bào tửủó hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng cú pha Tween 20 với nồng
ủộ 1/10.000 ủể rửa và lọc bào tử (20 ml nước ủể rửa bào tử cho một ủĩa petri). Lấy một dung dịch bào tửủó ủược lọc ở mỗi mẫu phõn lập nhỏ lờn lam và ủặt lờn soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch ủể cú khoảng 30 - 50 bào tử trờn một quang trường, tương ủương với 105 bào tử/ 1ml.
- Lõy nhiễm: Dựng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0,5l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay
ủó ủược lõy nhiễm vào trong tủ lõy nhiễm. Phun mự giữ ẩm liờn tục trong vũng 20 giờ (ẩm ủộ > 90%). Sau khoảng thời gian ủú ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra ngoài nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạủồng thời tưới nước ủầy ủủ cho lỳa ủể
lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển.
- ðỏnh giỏ: Sau 7 ngày lõy nhiễm tiến hành ủỏnh giỏ phản ứng của cỏc giống lỳa theo thang phõn cấp của Kato,1993 [62]
Cấp 0: Khụng cú vết bệnh, khỏng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ủầu kim, khỏng (R)
Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nõu nhạt ủến nõu tối, khỏng (R)
Cấp 3: Vết bệnh to hơn cú màu xỏm ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh ủiển hỡnh (hỡnh thoi màu xỏm ở giữa), nhiễm nặng (HS) Cấp 0, 1, 2: khỏng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
3.4.3.2. Phương phỏp xỏc ủịnh chủng sinh lý (Race) của cỏc mẫu phõn lập
nấm Pyricularia oryzae Cav.
- ðỏnh giỏ phản ứng khỏng bệnh của 12 giống lỳa chỉ thị của Nhật Bản với cỏc mẫu phõn lập nấm pyricularia oryzae Cav. bằng phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo. Mỗi giống lỳa này ủều cú gen khỏng bệnh ủạo ụn khỏc nhau
ủó ủược xỏc ủịnh và ủược mó hoỏ bằng cỏc chữ số.
- Từ kết quả phản ứng của 12 giống lỳa với cỏc mẫu phõn lập nấm
pyricularia oryzae Cav. (isolate), dựa vào mó số của cỏc giống và phản ứng
khỏng, nhiễm bệnh của chỳng ủể xỏc ủịnh cỏc chủng sinh lý (race) của nấm