3.4.2.1. Phương phỏp phõn lập nấm theo phương phỏp ủơn bào tử
- ðối với mẫu lỏ bệnh ủó bảo quản khụ ủem rửa sạch bằng nước mỏy sau ủú rửa bằng nước cất, cắt một ủoạn lỏ cú vết bệnh ủặt trong ủĩa petri cú giấy lọc ẩm, ủậy nắp, ủể ủĩa ở nhiệt ủộ 26 - 280C khoảng 1 - 2 ngày ủể cho nấm bệnh mọc.
- ðối với mẫu tươi thỡ tiến hành phõn lập ngay với cỏc bước tiếp theo: + Lấy ủĩa WA (Water agar), cầm ỳp mặt thạch, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ
bụng cú vết bệnh theo hỡnh tam giỏc, dựng panh cặp và ủặt cho bào tử ở vết bệnh dớnh vào bề mặt thạch, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi
ủưa lờn kớnh hiển vi dễ quan sỏt bào tử.
+ Dựng panh lấy một ớt bụng thấm nước, nhỳng vào cồn 96% rồi khử trựng kim thuỷ tinh.
+ ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiển vi, quan sỏt và nhẹ nhàng lấy bào tử vào ủầu kim thuỷ tinh (ủiều chỉnh kớnh và kim thuỷ tinh sao cho mỗi lần khờu lấy chớnh xỏc một bào tử nấm). Vặn cho vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4 khoanh ở bốn gúc của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thuỷ tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn một bào tử (mỗi
ủĩa PSA thả 4 bào tử)
+ ðậy nắp ủĩa lại và ủặt vào tủ ủịnh ụn cú nhiệt ủộ ổn ủịnh 260C- 280C. Sau 3- 4 ngày bào tử phỏt triển thành tản nấm, dựng que cấy nấm (ủó ủược vụ
trựng) lấy một mẩu thạch cú sợi nấm non cấy vào ống nghiệm cú mụi trường PSA nghiờng ủể giữ nguồn dựng nghiờn cứu.
3.4.2.2. Phương phỏp nghiờn cứu khả năng phỏt triển của nấm pyricularia
oryzae Cav. trờn cỏc mụi trường nhõn tạo
* Chuẩn bị mụi trường nghiờn cứu. Chuẩn bị 5 loại mụi trường: PSA, cỏm Agar, Bột gạo Agar, PGA và OMA.
Bước 1: Chuẩn bịủĩa petri
Rửa sạch bằng nước mỏy sau ủú khử trựng khụ ở 160o C trong 3 giờ.
Bước 2: Nấu mụi trường
+ Mụi trường PSA: Dựng 1kg khoai tõy ủõy ủó gọt sạch vỏ, cắt thành từng lỏt mỏng + 1 lớt nước ủun sụi 30 phỳt sau ủú dựng lớp vải màn kộp ủể lọc ta ủược nước khoai tõy (PB: Potato Broth). Lấy 200ml PB ủun sụi, cho vào ủú 20g ủường
ăn + 20g agar, ủổ thờm nước cất cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường PGA: làm tương tự như PSA nhưng thay ủường ăn (Sacaroza) bằng ủường ủơn glucoza.
+ Mụi trường OMA: Cho 50g bột mạch + 500ml nước cất khụng ion vào trong xoong và quấy ủều. Sau ủú ủặt lờn bếp ủun nhỏ lửa và cho thờm 20g ủường
ăn vào xoong và quấy ủều. Pha 20g agar vào trong 200ml nước cất khụng ion và lắc ủều rồi ủổ dung dịch này vào xoong dung dịch ủang ủun nờu trờn và quấy ủều. Cho thờm 300ml nước cất khụng ion vào xoong cho ủủ 1lớt mụi trường.
+ Mụi trường cỏm agar: Cho 20g cỏm vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
ủường ăn + 20g agar và bổ sung thờm nước cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường bột gạo agar: Cho 20g bột gạo vào trong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn, bỏ bó, Cho thờm vào dung dịch 5g
Bước 3: Hấp khử trựng mụi trường.
ðổ mụi trường vào bỡnh tam giỏc (333ml/ 500ml), ủậy lại bằng giấy bạc rồi
ủem hấp ở 121oC trong 20 phỳt, sau khi hấp xong, ủể mụi trường nguội dần ủến khoảng 600C thỡ thờm 0,1% Neomycin vào lắc ủều.
Bước 4: ðổ mụi trường vào ủĩa Petri ủó vụ trựng, ủể nguội sau ủú cấy nấm.
* Chuẩn bị nguồn nấm:
- Dựng que cấy lấy nấm từống nguồn, cấy vào ủĩa petri mụi trường PSA (cấy một ủiểm chớnh giữa trờn ủĩa) sau 4- 6 ngày nấm mọc thành tản nấm và dựng
ủú làm ủĩa nguồn ủể cấy nấm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cấy nấm: Từ nguồn nấm pyricularia oryzae Cav. thuần ủó mọc ở trờn
ủĩa PSA, dựng ủột trũn cú ủường kớnh 5 mm ủột nấm ở ủĩa nguồn theo ủường trũn ủồng tõm. Dựng que cấy nấm lấy từng khoanh cấy trờn 4 loại mụi trường
ủó chuẩn bị, mỗi ủĩa cấy một khoanh ở chớnh giữa, mỗi loại mụi trường, mỗi chủng phõn lập cấy 3 ủĩa (3 lần nhắc lại).
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi:
+ ðo ủường kớnh của tản nấm sau khi cấy nấm tại cỏc thời ủiểm sau cấy 2, 4, 6, 8, 10 ngày. ðo giỏn tiếp ở phớa ngoài của hộp, khụng mở nắp hộp, mỗi ủĩa ủo 2 lần theo hỡnh dấu +.
+ Xỏc ủịnh số lượng bào tử ủược hỡnh thành sau khi cấy 14 ngày, rửa sợi nấm, ủặt ủĩa nấm trong tủ 12 giờ sỏng 12 giờ tối trong 3 ngày ủể nấm sinh bào tử. Dựng 20ml Tween 20 với nồng ủộ 1/10.000 rửa bào tử. Lấy 0,1 ml nước tween 20 cú bào tử cho lờn lam kớnh, ủậy lamen lại sau ủú ủưa vào vựng ủếm và ủặt lờn kớnh hiển vi quang học 10X , ủếm bào tử của 5 quang trường. Từủú tớnh số bào tử cú trong 1 ml rồi tớnh số bào tử nấm/cm2 mặt mụi
trường nuụi cấy ủể so sỏnh sự hỡnh thành bảo tử của cỏc chủng sinh lý nấm
pyricularia oryzae Cav.