3. ðỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2.Phương pháp nghiên cứu
3.3.2.2 Phương pháp lấy mẫu sữa
Chuẩn bị ống nghiệm đựng sữa, ống nghiệm phải được đánh số, hấp sấy vơ trùng. Nguyên tắc đánh số.
1.Vú phải trước 2. Vú phải sau 3. Vú trái trước 4. Vú trái sau
Khi bầu vú đã được rửa sạch dùng bơng thấm cồn 70oC sát trùng núm vú. trước khi vắt sữa bỏ mấy giọt sữa đầu, sau đĩ lấy mẫu sữa vào ống nghiệm chú ý tránh núm vú chịn vào miệng ống nghiệm. Vắt sữa vào ống nghiệm vơ trùng theo đúng thứ tựở trên (National Mastitis Council.1980[35].
Trước khi sử dụng làm ấm sữa bằng cách ngâm vào nước ấm 370C/15 phút, lắc mạnh khoảng 25 lần trong 7 giây để mẫu sữa tan, trước khi sử dụng trộn lại vài lần.
3.3.2.3. Phương pháp kiểm tra vi khuẩn trong sữa.
Sơđồ xét nghiệm vi khuẩn hiếu khí
Sơđồ xét nghiệm vi khuẩn hiếu khí( Làm tại trung tâm chẩn đốn thú y Quốc Gia)
ðể tủấm 370C/24h
Cấy chuyển các khuẩn lạc sang các mơi trường thơng thường và chọn lọc
Vi khuẩn Gram dương V khuẩn Gram âm
Cầu khuẩn Trực khuẩn
- Corynebacterium
- Bacillus sp.
Catalaza Oxydaza
Dương tính Âm tính Âm tính Dương tính
(Theo Trung tâm chẩn đốn Thú y Quốc Gia)
Bệnh phẩm
Thạch máu Thạch
MacConkey Nước thịt Mơi trườlọc ng chọn
Staphylococcus Streptococcus
Enterobacteriacae Non-
Enterobacteriacae Phản ưng đơng vĩn
huyết tương thỏ Indol, TSI, di động, gelatin, ure, VP, MR Indol, TSI, di động, gelatin, ure, VP, MR Dương tính Âm tính Sta. Aureus or Sta. Intermedius or Staphylococcus sp - E. coli - Salmonella - Pasteurella - Pseudomonas Tiêm động vật thí nghiệm
Sơ đồ kiểm tra vi khuẩn trong sữa (theo Carter G.R, 1995) CMT California Mastitis Mẫu sữa đã xử lý Phiết kính nhuộm Methylene blue, đếm tế bào bạch cầu Ly tâm 2500-3000 vịng/phút trong 15 phút, lấy cặn Thạch máu (B.A) Chọn những khuẩn lạc khác nhau, làm
tiêu bản nhuộm gram, kiểm tra hình thái
Tiến hành một số phản ứng đặc biệt để nhận
biết, phân lập trên các mơi trường đặc biệt,
Sơ đồ phân lập Streptococcus và Staphylococcus(theo Carter G.R, 1995) ` Thạch máu (B.A) Gram Catalase (-), khuẩn lạc nhỏ, trong suốt Edward medium Streptococcus (khuẩn lạc trịn, nhỏ, trong, dạng S) Giám định
Kiểm tra đặc tính nuơi cấy (Thạch thường, nướcthịt, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thạc máu)
Kiểm tra đặc tính sinh hĩa
Catalase (-), khuẩn lạc to, đục trắng hoặc vàng
cĩ thể cĩ
Staphylococcus medium (hoặc Sapman)
Staphylococcus (Mơi trường cĩ màu vàng)
Giám định
Kiểm tra đặc tính nuơi cấy (Thạch thường, nướcthịt,
gelatin)
Kiểm tra đặc tính sinh hĩa
Glucose Lactose Saccharose Salixin Trehalose H2S Glucose Lactose Saccharose Manitol H2
CMT California Mastitis Mẫu sữa đã xử lý Phiết kính nhuộm Methylene blue, đếm tế bào bạch cầu
Sơ đồ phân lập E.coli (theo Carter G.R, 1995)
Bị bình thường Mẫu sữa Bị viêm vú
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiến dạng S – màu vàng)
ðếm số khuẩn lạc E.M.B
Khuẩn lạc tím đen
Macconkey
Khuẩn lạc đỏ
Khuẩn lạc thuần khiết
Endo Khuẩn lạc đỏ Brillian green Khuẩn lạc vàng chanh Tính chất sinh học Giữ trên thạch máu
Hình thái nuơi cấy ðặc tính sinh hĩa
Saccaroza Galactoza Glucoza Lactoza Kligler VP MR H2S Hình Di động Gelatin Lismusmilk thái gan
* Phương pháp giám định một số vi khuẩn:
Sau khi nhận biết khuẩn lạc của vi khuẩn trên thạch máu và các đặc
điểm hình thái của chúng, tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hĩa cơ bản, sử
dụng một số biện pháp để phân biệt một số lồi vi khuẩn gây bệnh chính. - Phương pháp định danh Steptoccus gây viêm vú bị sữa:
Phương pháp CAMP: phản ứng CAMP được Comalli M.P và cs [28] phát minh và sử dụng để phân biệt các Streptococcus nhĩm B( các Streptococcus gây bệnh viêm vú bị thuộc nhám B). Phản ứng dựa trên nguyên lý: Streptococcus nhĩm B sản sinh một chất cĩ thành phần giống Protein được gọi là CAMP factor, nĩ cĩ thể cộng hoạt với tốc độβ Hemolysin của Staphylococcus aureus tạo ra một vịng dung huyết hồn tồn, hình mũi tên trên vùng dung huyết khơng hồn tồn (β) của Sta.aureus.
Hillerton J.E.và cs (1996)[33]Ngày nay, phản ứng CAMP được cải tiến bằng cách cho thêm vào mơi trường làm phản ứng 0,1% Esculinvà 0,01% Ferric Citrat để xác (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
định các Steptococcus cĩ khả năng phân giải Esculin và phản ứng được gọi là CAMP- Esculin test.
Tiến hành: Cấy một đường thẳng Staphylococcus aureus chủng chuẩn ( dung huyết 2 vịng α và β) chia đơi đĩa thạch (0,1% Esculin và 0,01% Ferric Citrat). Sau đĩ cấy các Streptococcus cần phân biệt theo hướng vuơng gĩc và cách đường cấy Staphylococcus trên từ 2-3mm. Bồi dưỡng ở 37 0C/24h
Kết quả CAMP (+): Xuất hiện vùng dung huyết hồn tồn hình mũi tên nơi tiếp giáp giữa đường cấy Streptoccocus với vùng dung huyết β của staphylococus aureus.
CAMP- Esculin test cho phép phân biệt các loại Streptococcus theo bảng sau:
Vi khuẩn CAMP Esculin Dung huyết
Strep. agalactiae + - α,β
Strep.dysgalactiae - - Α
+ Phương pháp định danh một số loại Staphylococcus (Hogan và cộng sự 1992[33], Smith T.L[39] .Staphylococcus bao gồm các chủng gây bệnh của Staphylococcus aureus đã được xác định là men Coagulase được sinh ra trong quá trình sống. Người ta cĩ thể dựa vào sự cĩ mặt của men này để phân biệt các Straphylococus gây bệnh với Staphylococcus khác. Phản ứng dùng để
phân biệt này gọi là Coagulase test.
- Nguyên lý của phản ứng: Các chủng Straphylococcus aureus trong quá trình sống cĩ khả năng tiết ra một loại men Coagulase phân giải Fibrinogen thành Fibrin làm đơng huyết tương của một sốđộng vật.
- Phản ứng Coagulase trên phiến kính: Chuẩn bị đĩa cấy vi khuẩn cần phân biệt, nước sinh lý trên một lam kính vơ trùng, dùng que cấy lấy một vùng huyết tương thỏ Citrat hĩa trộn đều với hỗn hợp trên. Nếu phản ứng dương tính thì hiện tượng đơng vĩn sẽ xuất hiện sau vài giây.
3.3.2.4 Phương pháp kiểm tra viêm vú phi lâm sàng bằng thuốc thử CMT ( California Mastitis Test)
Dụng cụ: - Khay thử CMT (cĩ 4 ơ riêng biệt)
- Thuốc thử CMT
Hình 3.1 b: Vắt sữa vào khay
Hình 3.1d: ðọc kết quả
( Nguồn: www. Infovets.com)
Nguyên lý: Thuốc thử CMT cĩ tính chất tẩy, nĩ tác động phá hủy màng tế bào và gắn với AND được giải phĩng ra. Khi bị bị viêm vú (trong sữa cĩ trên 500.000 tế bào/ml sữa) chúng làm thay đổi trạng thái ban đầu của sữa, sữa trở thành một hỗn hợp nhớt.
Thành phần của thuốc thử CMT bao gồm (Pha tại phịng vi trùng- Trung tâm chẩn đốn Thú y Quốc gia)
- Deterol 85- 90% = 50g - Bromo cresol thinh khiết = 0 - Nước cất vừa đủ = 1lit
Cách tiến hành: Theo Nguyễn Ngọc Nhiên, Lê Văn Tạo, Cù Hữu Phú, Khương Bích Ngọc (1997)[20], do lượng tế bào thân cĩ xu hướng tăng trong thời gian tiết sữa vẫn giữ số lượng cao trong nhiều giờ sau kể cảở những núm vú khơng bị bệnh nên sữa được lấy để tiến hành thử nghiệm này là sữa đầu tiên của lần vắt sữa đĩ (sau khi đã kích thích bị tiết sữa và loại bỏ những giọt sữa đầu tiên). Vắt sữa của từng núm vú vào từng ơ của khay thử CMT, sau đĩ
cho một lượng tương đương thuốc thử CMT vào và lắc trịn tay. Kết quảđược
đánh giá sau:
Kết quảđược đánh giá theo thang chuẩn sau
Mức độ phản
ứng
Trạng thái và màu của hốn hợp sữa - thuốc thử
Số lượng tế bào thân (TB/1ml sữa)
- (âm tính) Trạng thái sữa khơng đổi, giữ nguyên màu thuốc thử
< 200.000 + (dương tính) Hơi cĩ vết nhớt khi nghiêng đĩa, màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hỗn hợp khơng đổi
150.000- 500.000 ++ (dương tính) Sữa hơi dính, hơi chuyển màu thuốc