Muốn xác ñịnh hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem trước hết phải chiết tách ñể lấy dầu Neem và chiết hoạt chất azadirachtin sau ñó mới tiến hành ñịnh lượng hàm lượng hoạt chất Azadirachtin trên máy sắc ký lỏng HPLC.
* Phương pháp chiết lấy dầu (Neem oil) trước khi tách chiết hoạt chất (Azadirachtin)
Nguyên tắc là dùng dung môi không phân cực (n-hexan, benzen) ñể
chiết dầu Neem trước khi dùng dung môi phân cực (MeOH, EtOH) ñể chiết hoạt chất azadirachtin.
Phương pháp chiết dầu bằng n-hexane: Lấy 100 g nhân hạt Neem nghiền nhỏ (0,3-0,5mm), cho vào 300 ml n-hexane khuấy ñều, ngâm trong 12 h , sau ñó ly tâm thu pha n-hexane, lọc qua 30g Na2SO4, cất quay chân không thu ñược dầu Neem.
* Phương pháp chiết lấy dầu (Neem oil) ñồng thời với hoạt chất (Azadirachtin)
Nguyên tắc là dùng hệ dung môi không phân cực (n-hexan, benzen) và dung môi phân cực (MeOH , EtOH) ñể chiết dầu Neem và hoạt chất azadirachtin một cách ñồng thời.
Phương pháp chiết ñồng thời bằng n-hexane và EtOH: Lấy 100 g nhân hạt Neem nghiền nhỏ (0,3-0,5mm), cho vào 300 ml n-hexane và 200 ml EtOH, khuấy ñều, ngâm trong 24 h, sau ñó ly tâm thu pha n-hexane, lọc qua 30 g Na2SO4 , cất quay thu ñược dầu Neem.
* Phương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dịch chiết + Phương pháp chiết tạo dịch chiết:
Bước 1: 100 g hạt/lá Neem ñược nghiền nhỏ (d= 0,5 mm ± 0,2mm) cho vào cốc dung tích 1000 ml
Bước 2: Cho 300 ml n-hexane, rung siêu âm 30 phút (hoặc ngâm trong 24 h), chuyển sang ly tâm (3000 vòng/ 2 phút), gạn lấy pha n-hexane
Bước 3: Lặp lại bước 2 với phần bã, thu và gộp pha n-hexane với bước 2. Lọc qua 30 g Na2SO4 , cất quay chân không thu ñược lượng dầu Neem
Bước 4: Cho 200 ml MeOH 95% vào phần bã, rung siêu âm 30 phút (hoặc ngâm trong 24 h), chuyển sang ly tâm (3000 vòng/ 2 phút), thu phần dung dịch.
Bước 5: Lặp lại bước 4, thu và gộp phần dung dịch, xác ñịnh thể tích dung dịch chiết thu ñược.
+ ðịnh lượng azadirachtin trong dịch chiết:
Bước 1: Lấy 50 ml dịch chiết cho vào bình chiết, bổ sung 100 ml n-hexane, lắc kỹ và bỏ lớp n-hexane chứa dầu còn sót lại.
Bước 2: Lọc qua giấy lọc No.2 pha MeOH, có 20 Na2SO4 khan ñể loại nước
Bước 3: Thu dịch lọc, ñịnh mức bằng MeOH cho ñủ 50 ml
Bước 4: Lấy 1 ml, pha loãng 100 lần
Bước 5: Lấy 1,5 ml dung dịch ñã pha loãng, lọc qua bơm lọc,cho vào lọ mẫu
Bước 6: Chạy mẫu trên HPLC Agilent 1100 Phương pháp ngoại chuẩn:
Tốc ñộ dòng: 0.5 ml/min; Bước sóng thu nhận tín hiệu: 217nm Lượng mẫu bơm: 5ul; Thời gian chạy mẫu: 10 phút.
* Phương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dầu Neem ép nguội và bã hạt Neem sau khi ép nguội.
Phương pháp chiết xuất dầu bằng hệ dung môi rất phức tạp và tốn kém, mặt khác lượng dầu thu ñược rất khó triệt ñể. Do ñó chúng tôi nghiên cứu thử
nghiệm thêm phương pháp ép dầu bằng thiết bị ép nguội ñã ñược thiết kế mới phù hợp (dạng trục xoắn - côn ép) tại Việt Nam.
Cách tiến hành: Hạt neem ñược phơi khô,tách vỏ bằng máy sau ñó ép nhân hạt Neem không dùng nhiệt và hoá chất, sử dụng máy ép dạng rãnh xoắn , ép côn với áp lực ép lớn và có kèm thiết bị lọc ñể thu ñược dầu Neem tự
nhiên(bao gồm dầu và cả các hoạt chất có trong nhân hạt Neem), bã hạt Neem. Bã hạt Neem (Bánh ép dầu): là sản phẩm còn lại của nhân hạt Neem sau khi ép nguội (ñược cán mỏng).
Lá Neem: lá bánh tẻ của cây Neem 7- 9 tuổi, phơi khô kiệt trong bóng râm. Cách chiết và ñịnh lượng hoạt chất của hai loại này theo phương pháp chiết và phương pháp ñịnh lượng dịch chiết .
+ Phương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dầu Neem ép nguội Bước 1: Lấy 20 ml dầu cho vào bình chiết, bổ sung 100 ml ete dầu hỏa;
Lắc ñều và rung siêu âm 30 phút
Bước 2: Thu lớp dịch chứa aza ñã kết tủa vào một bình cầu nhỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðể lắng và gạn nhẹ nhàng loại phần lỏng giữ lại phần aza kết tủa
Bước 3: Cho vào bình cầu 15 ml MeOH, rung siêu âm ñể hoà tan azadirachtin.
ðịnh mức bằng MeOH cho ñủ 20 ml
Bước 4: Lấy 1,5 ml lọc qua bơm lọc, cho vào lọ mẫu
Bước 5: Chạy mẫu trên Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Agilent 1100 )như ở bước 6 của phương pháp ñịnh lượng azadiractin trong dịch chiết.
* Phương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong bã Neem sau khi ép nguội Bước 1: Cân 20 g bã nhân hạt Neem xay ñồng nhất với 20 ml n- Hexan và 30
ml EtOH. Ngâm dung dịch trong 5 giờở 550c.
Bước 2: Dung dịch ñể sau 5 tiếng ñược cho ra máy quay ly tâm trong vòng 3 phút, thu phần dịch lỏng ở phía trên.
Bước 3: Cho phần dịch lỏng vào bình cầu nhỏ cất quay chân không .
Bước 4: Sau ñó tiếp tục bổ xung 30 ml n- hexan lắc ñều và rung siêu âm 10 phút. Phần lỏng và aza kết tủa thu vào bình cầu nhỏ. ðể lắng gạn loại phần lỏng, giữ phần kết tủa.
Bước 5: Cho 10 ml MeOH vào bình cầu hòa tan phần kết tủa. Chuyển ra ống
ñong và thêm MeOH ñịnh mức ñủ 20 ml. Lấy 1 ml và phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
2.3.2 ðánh giá trong phòng tác ñộng của các sản phẩm từ cây Neem và các sản phẩm từ cây Neem kết hợp với chất phụ gia, chất trợ lực thảo