3.1. Thiết kế nghiờn cứu:
Trong nghiờn cứu này thiết kế nghiờn cứu được thực hiện là nghiờn cứu cắt ngang và sử dụng mẫu ngẫu nhiờn đơn.
3.2. Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiờn cứu: 3.2.1. Chọn mẫu: 3.2.1. Chọn mẫu:
Mẫu huyết thanh, mẫu dịch nóo tuỷ lấy từ bệnh nhõn HCNC nghi ngờ do vi rỳt từ năm 1998 - 2007, cỏc mẫu được lấy và bảo quản theo quy định chung cho việc lấy mẫu để chẩn đoỏn cỏc bệnh do nhiễm vi rỳt Arbo cú hướng tớnh thần
kinh như vi rỳt West Nile, vi rỳt VNNB. Cỏc mẫu huyết thanh sử dụng trong chẩn đoỏn khụng bị huyết tỏn hoặc nhiễm trựng.
Chọn mẫu theo tiờu chuẩn lý tưởng đối với một bệnh nhõn HCNC nghi ngờ do vi rỳt: cú được mẫu dịch nóo tuỷ và mẫu huyết thanh kộp lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục. Đối với cỏc mẫu đơn dịch nóo tuỷ và huyết thanh được chọn trong nghiờn cứu là những mẫu mỏu được lấy sau mắc bệnh 7 ngày.
3.2.2. Cỡ mẫu:
Cỡ mẫu dự kiến thực hiện là 700 mẫu, mỗi mẫu được xột nghiệm 2 lần với khỏng nguyờn vi rỳt VNNB genotyp 1 và genotyp 3. Thực tế số mẫu sử dụng cho nghiờn cứu là 788 mẫu được thu thập từ 671 bệnh nhõn trong cỏc năm 1998 - 2007 bao gồm: cú 300 bệnh nhõn chỉ thu thập được một mẫu dịch nóo tuỷ, 290 bệnh nhõn chỉ thu thập được một mẫu huyết thanh, 45 bệnh nhõn thu thập được mẫu huyết thanh kộp, 36 bệnh nhõn thu thập được mẫu dịch nóo tuỷ và mẫu
Mẫu để so sỏnh độ nhạy của cỏc bộ sinh phẩm phỏt hiện IgM khỏng vi rỳt VNNB: chọn 100 mẫu huyết thanh và dịch nóo tuỷ của bệnh nhõn viờm nóo vi rỳt thu thập trong năm 2007 ở Thỏi Bỡnh để chẩn đoỏn VNNB.
3.2.3. Đối tượng nghiờn cứu:
Những bệnh nhõn HCNC cú chẩn đoỏn lõm sàng nghi ngờ do vi rỳt với điều kiện dịch nóo tuỷ trong, khụng mầu.
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu: 3.3.1. Chỉ tiờu nghiờn cứu: 3.3.1. Chỉ tiờu nghiờn cứu:
- Xỏc định độ nhạy của kỹ thuật MAC-ELISA đối với những mẫu mỏu và dịch
nóo tuỷ của cựng một bệnh nhõn lấy trong 7 ngày đầu của bệnh.
- So sỏnh độ nhạy và đặc hiệu của khỏng nguyờn vi rỳt VNNB genotyp 1 và genotyp 3 trong chẩn đoỏn VNNB.
- So sỏnh độ nhạy của bộ sinh phẩm MAC-ELISA, PEN TAX và PanBio phỏt hiện IgM trong mẫu huyết thanh và DNT.
- Xỏc định căn nguyờn vi rỳt VNNB gõy HCNC trong số trẻ trẻ chưa tiờm vắc- xin VNNB và trong số trẻ đó tiờm vắc-xin VNNB. Trờn cơ sở đú, ước tớnh: tỷ lệ mắc VNNB trong số trẻ chưa tiờm vắc-xin VNNB trong nhúm trẻ từ 1 đến 5 tuổi, tỷ lệ mắc VNNB trong số trẻ đó tiờm vắc-xin VNNB trong nhúm trẻ từ 1 – 5 tuổi (kể cả cỏc trường hợp tiờm khụng đỳng quy định như khụng tiờm đủ 3 liều vắc-xin cơ bản).
- Xỏc định căn nguyờn vi rỳt Arbo khỏc gõy HCNC mới được phỏt hiện ở Việt Nam như vi rỳt Nam Định.
3.3.2. Phương phỏp xỏc định cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu:
Cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu xỏc định dựa trờn cơ sở nguyờn lý kỹ thuật túm bắt IgM để chẩn đoỏn VNNB.
- Những trường hợp dương tớnh với khỏng nguyờn VNNB được kiểm tra xỏc
định lại với khỏng nguyờn vi rỳt Dengue 4 typ để loại trừ cỏc trường hợp
HCNC do vi rỳt Dengue.
- Xỏc định tỷ lệ cú kết quả chẩn đoỏn phự hợp và khụng phự hợp giữa 3 loại bộ sinh phẩm.
3.3.2.1. Nguyờn lý kỹ thuật MAC-ELISA phỏt hiện IgM [3, 37, 51]:
Kháng IgM gắn trên bản nhựa
KN VNNB Mẫu: IgM kháng VNNB Mẫu: IgM kháng VNNB IgG kháng VNNB gắn HRPO IgG IgG khkháángngVNNB VNNB g
gắắn HRPOn HRPO IgMIgMkhkháángngVNNBVNNB
KN KN VNNBVNNB KN VNNBVNNB
H2SO4
OPD
Hỡnh 3.1. Sơ đồ kỹ thuật MAC-ELISA của VNNB
Kỹ thuật phỏt hiện khỏng thể IgM khỏng virut VNNB (JE IgM capture ELISA) gọi tắt theo tiếng Anh là MAC – ELISA dựa trờn nguyờn lý sử dụng một IgG khỏng IgM người đặc hiệu chuỗi à gắn trờn phiến nhựa; IgM người cú trong mẫu xột nghiệm kết hợp với IgG khỏng IgM cú trong mẫu xột nghiệm; khi cho tiếp xỳc với khỏng nguyờn VNNB, nếu trong mẫu xột nghiệm cú IgM
khỏng vi rỳt VNNB, sẽ cú phản ứng kết hợp khỏng nguyờn và khỏng thể; khi cho tiếp xỳc với cộng hợp là IgG khỏng vi rỳt VNNB gắn enzym HRPO, phản
ứng kết hợp sẽ xẩy ra. Phỏt hiện phản ứng khỏng nguyờn khỏng thể được thực
hiện khi cho một dung dịch cơ chất khụng mầu Otho - Phenylenediamin / Hydrogen Peroxide, với sự xỳc tỏc của Hydrogen Peroxide và sự cú mặt của khỏng thể gắn enzym HRPO, dung dịch cơ chất sẽ chuyển từ khụng màu thành màu vàng. Dừng phản ứng bằng a xớt, màu vàng chuyển thành màu nõu. Sự cú mặt của IgM đặc hiệu khỏng vi rỳt VNNB trong mẫu được xỏc định giỏn tiếp qua sự chuyển màu và được ghi lại bằng mỏy đọc ELISA ở bước súng phự hợp về sự thay dổi mật độ quang học (optical density viết tắt OD).
* Phỏt hiện IgM khỏng vi rỳt West Nile trong cỏc mẫu dịch nóo tuỷ bằng kỹ thuật MAC-ELISA.
* Phỏt hiện IgM khỏng vi rỳt Nam Định trong cỏc mẫu dịch nóo tuỷ bằng kỹ thuật ELISA IgM giỏn tiếp.
3.3.2.2. Tiờu chuẩn nhận định kết quả: