Thí nghiệm xác định mức độ sai khác ở mức phân tử trên các dạng biến dị

Một phần của tài liệu Nghiên cứu hiện tượng biến dị trong nuôi cấy in vitro cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh nghệ an (Trang 37 - 40)

- Tách chiết ADN theo ph−ơng pháp CTAB của Saghai- Maroof (1994) cải tiến, cụ thể nh− sau: Lấy mẫu lá chuối t−ơi (khoảng 4 gr) nghiền trong nitơ

lỏng cho tới dạng bột mịn, sau đó, mẫu đ−ợc giữ ở – 200C ít nhất trong 2 giờ, bổ sung dung dịch đệm CTAB (Cetyltrimethylamonium bromide) (1,5% CTAB + 100 mM Tris-HCl (pH8) + 20 mM EDTA + 1,4 M NaCl) đã đ−ợc đun đến vừa sôi để đạt nồng độ CTAB cuối cùng là 1,0% và lắc ngay với tốc độ 97 vòng/phút ở 560C trong 30 phút.

- Phản ứng RAPD đ−ợc thực hiện trên máy PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research, các đoạn mồi sử dụng có trình tự nh− sau:

TT Tên Trình tự các Nucleotit 1 OBA1 5’ - TTCCCCACCC - 3’ 2 OBA2 5’ - TGGTGGGCTC - 3’ 3 OBA5 5’ - TGGGTTCCAC - 3’ 4 OBA6 5’ - GGACGACCGT - 3’ 5 OBA7 5’ - GGGTCGCATC - 3’ 7 OBA10 5’ - GGACGTTGAG - 3’ 8 OBA11 5’ - CCACCTTCAG - 3’ 9 OBA12 5’ - TGTTGGGCAC - 3’ 10 OBA17 5’ – TCAGTTGGAC - 3’ 11 OBC2 5’ – ACAGTAGCGG - 3’ 12 OBB7 5’ –GAAGGCTGGG - 3’ 13 OBC4 5’ – GCACGTGCCA - 3’ 14 OBC8 5’ – GGTCTTCCCT - 3’ 15 OBB6 5’ – GTGAAGCTGG - 3’ 16 OBB3 5’ – TCACGTGGCT - 3’

Mỗi phản ứng PCR có thể tích cuối cùng 25 àl chứa 20 ng ADN khuôn mẫu; 4 loại dNTP, mỗi loại 200 àM; 2,5 đơn vị Taq- polymeraza; 15 ng primer; 10 mM Tris- HCl (pH 8,3); 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,001% (w/v) gelatin; 20 ng ADN genom; hỗn hợp phản ứng đ−ợc phủ bằng một giọt dầu khoáng,

phản ứng gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: biến tính ở 940C/1phút, ủ mồi ở 360C/1phút, kéo dài đoạn mồi ở 720C/2phút.

Sau khi phản ứng kết thúc, giữ ở nhiệt độ 40C, sản phẩm của phản ứng PCR đ−ợc điện di trên gel agarose 1,1% ở điện áp 100 V trong 150 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium brommide 0,1%, cuối cùng chụp bằng phim Polariod 667 d−ới ánh sáng cực tím, mỗi phản ứng đều đ−ợc lặp lại 3 lần.

3.3.7. Ph−ơng pháp thu thập và xử lý số liệu

- Số liệu sơ cấp thu thập thông qua thành lập phiếu điều tra và tiến hành điều tra tại địa bàn nghiên cứu.

- Số liệu thứ cấp thu thập thông qua kết quả nghiên cứu của một số ch−ơng trình, đề tài và các cơ quan có liên quan trên địa bàn.

Các số liệu trên đ−ợc đ−a vào ch−ơng trình phần mềm NTSYSpc để phân tích và đánh giá mức độ t−ơng đồng giữa các mồi nghiên cứu và xây dựng cây phân loại cho các biến dị. Hệ số t−ơng động do phần mềm tính toán dựa trên công thức toán học của Nei và Li:

2Nxy Sxy =

Nx + Ny Trong đó:

2Nxy : Số băng chung xuất hiện ở cả 2 mẫu x và y. Nx : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu x.

Ny : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu y.

- Số liệu đ−ợc xử lý trên máy tính theo ch−ơng trình EXCEL và IRRISTART.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu hiện tượng biến dị trong nuôi cấy in vitro cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh nghệ an (Trang 37 - 40)