- Tách chiết ADN theo ph−ơng pháp CTAB của Saghai- Maroof (1994) cải tiến, cụ thể nh− sau: Lấy mẫu lá chuối t−ơi (khoảng 4 gr) nghiền trong nitơ
lỏng cho tới dạng bột mịn, sau đó, mẫu đ−ợc giữ ở – 200C ít nhất trong 2 giờ, bổ sung dung dịch đệm CTAB (Cetyltrimethylamonium bromide) (1,5% CTAB + 100 mM Tris-HCl (pH8) + 20 mM EDTA + 1,4 M NaCl) đã đ−ợc đun đến vừa sôi để đạt nồng độ CTAB cuối cùng là 1,0% và lắc ngay với tốc độ 97 vòng/phút ở 560C trong 30 phút.
- Phản ứng RAPD đ−ợc thực hiện trên máy PTC-100 Programmable Thermal Controller MJ Research, các đoạn mồi sử dụng có trình tự nh− sau:
TT Tên Trình tự các Nucleotit 1 OBA1 5’ - TTCCCCACCC - 3’ 2 OBA2 5’ - TGGTGGGCTC - 3’ 3 OBA5 5’ - TGGGTTCCAC - 3’ 4 OBA6 5’ - GGACGACCGT - 3’ 5 OBA7 5’ - GGGTCGCATC - 3’ 7 OBA10 5’ - GGACGTTGAG - 3’ 8 OBA11 5’ - CCACCTTCAG - 3’ 9 OBA12 5’ - TGTTGGGCAC - 3’ 10 OBA17 5’ – TCAGTTGGAC - 3’ 11 OBC2 5’ – ACAGTAGCGG - 3’ 12 OBB7 5’ –GAAGGCTGGG - 3’ 13 OBC4 5’ – GCACGTGCCA - 3’ 14 OBC8 5’ – GGTCTTCCCT - 3’ 15 OBB6 5’ – GTGAAGCTGG - 3’ 16 OBB3 5’ – TCACGTGGCT - 3’
Mỗi phản ứng PCR có thể tích cuối cùng 25 àl chứa 20 ng ADN khuôn mẫu; 4 loại dNTP, mỗi loại 200 àM; 2,5 đơn vị Taq- polymeraza; 15 ng primer; 10 mM Tris- HCl (pH 8,3); 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,001% (w/v) gelatin; 20 ng ADN genom; hỗn hợp phản ứng đ−ợc phủ bằng một giọt dầu khoáng,
phản ứng gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: biến tính ở 940C/1phút, ủ mồi ở 360C/1phút, kéo dài đoạn mồi ở 720C/2phút.
Sau khi phản ứng kết thúc, giữ ở nhiệt độ 40C, sản phẩm của phản ứng PCR đ−ợc điện di trên gel agarose 1,1% ở điện áp 100 V trong 150 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium brommide 0,1%, cuối cùng chụp bằng phim Polariod 667 d−ới ánh sáng cực tím, mỗi phản ứng đều đ−ợc lặp lại 3 lần.
3.3.7. Ph−ơng pháp thu thập và xử lý số liệu
- Số liệu sơ cấp thu thập thông qua thành lập phiếu điều tra và tiến hành điều tra tại địa bàn nghiên cứu.
- Số liệu thứ cấp thu thập thông qua kết quả nghiên cứu của một số ch−ơng trình, đề tài và các cơ quan có liên quan trên địa bàn.
Các số liệu trên đ−ợc đ−a vào ch−ơng trình phần mềm NTSYSpc để phân tích và đánh giá mức độ t−ơng đồng giữa các mồi nghiên cứu và xây dựng cây phân loại cho các biến dị. Hệ số t−ơng động do phần mềm tính toán dựa trên công thức toán học của Nei và Li:
2Nxy Sxy =
Nx + Ny Trong đó:
2Nxy : Số băng chung xuất hiện ở cả 2 mẫu x và y. Nx : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu x.
Ny : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu y.
- Số liệu đ−ợc xử lý trên máy tính theo ch−ơng trình EXCEL và IRRISTART.