a) Làm mođi trường gieo cây vi sinh vaơt Tiên hành:
Cađn 80g malt + 400ml nước cho vào erlen 1000ml. Đun cách thụy ở: nhieơt đoơ t1 = 45 – 50oC trong 30 phút. Nhieơt đoơ t2 = 68 – 72oC trong 1giờ.
Thử với iod đeơ kieơm tra xem quá trình thụy phađn có xạy ra hoàn toàn hay khođng. Nêu quá trình thụy phađn xạy ra hoàn toàn khi nhỏ liugon vào khođng làm thay đoơi màu.
Lĩc qua bođng đeơ lối bã malt.
Hâp ở 121oC trong 20 phút đeơ kêt tụa protein. Sau đó lĩc qua giây lĩc đeơ lối kêt tụa.
Đo đoơ đường: dùng balling kê đo đoơ đường. Nêu đoơ đường lớn hơn 7 ta phại pha loãng veă 7 vì noăng đoơ cao sẽ ức chê vi sinh vaơt. Chú ý: balling kê phại được lau sách khođng có vêt baơn.
Cách hieơu chưnh đoơ đường:
Trong đó: V1: theơ tích dịch malt lúc đaău. n1: noăng đoơ đường lúc đaău.
V2: theơ tích dịch malt lúc sau (sau khi đã theđm nước). n2: noăng đoơ đường lúc sau, n2 = 7. V2 = V1n1/n2 Lượng nước cho theđm vào là: V = V2 – V1. Lượng agar cho vào: 2% (w/v). Đun chạy agar cho tan đeău.
Phađn phôi mođi trường vào các ông nghieơm: ½ theơ tích ông nghieơm (đeơ đoơ vào hoơp petri) và ¼ theơ tích ông nghieơm (làm ông thách nghieđng).
Cách làm như sau:
Đaịt pheêu vào ông nghieơm.
Đoơ mođi trường vào pheêu với lượng theơ tích là ½ và ¼ ông nghieơm. Đaơy nút bođng lái, vaịn sađu vào gaăn hêt nút, đaịt leđn giá. Khođng đeơ mođi
trường dính leđn mieơng ông nghieơm và nút bođng.
Hâp vođ khuaơn baỉng hơi nước bão hòa ở 1at trong 20 phút.
Sau khi hâp đem làm thách nghieđng (ông chứa ¼): đaịt thách ở vị trí nghieđng thích hợp sao cho chieău dài thách khođng vượt quá 2/3 ông nghieơm, khođng chám vào nút bođng, maịt nghieđng baỉng phẳng, khođng bị đứt, chieău dài vừa phại, khođng ngaĩn quá, dài quá.
b) Làm mođi trường nhađn giông
Mođi trường nhađn giông được làm tương tự như mođi trường gieo cây, tuy nhieđn thođng thường mođi trường nhađn giông là mođi trường lỏng neđn khođng có bước boơ sung theđm agar.
Quá trình nhađn giông thường qua 2 giai đốn: nhađn giông câp 1 và câp 2.
− Mođi trường nhađn giông câp 1 thường là mođi trường malt 100%, hàm lượng chât khođ 8o Bx.
− Mođi trường nhađn giông câp 2 thường là mođi trường có boơ sung theđm moơt phaăn dịch leđn men đeơ nâm men có theơ thích nghi tôt với đieău kieơn cụa mođi trường leđn men.
Quá trình nhađn giông và cho cây giông vào dịch leđn men được tiên hành như sau:
− Nhađn giông câp 1: lây 1 vòng que cây nâm men từ ông giông thách nghieđng cho vào ông nghieơm chứa 10 mL dịch malt. Nuođi ở nhieơt đoơ thường khoạng 6-8g
− Nhađn giông câp 2: cho 10 mL dịch nhađn giông câp 1 vào erlen 250 mL chứa dịch nhađn giông câp 2. Dịch nhađn giông câp 2 bao goăm dịch malt và dịch dưa hâu theo tư leơ 1:1. Nuođi ở nhieơt đoơ thường tređn máy laĩc.
− Đêm sô tê bào nâm men trong dịch nhađn giông câp 2 đeơ xác định theơ tích boơ sung vào dịch leđn men.
− Cây giông vào dịch leđn men theo tư teơ mong muôn.
Yeđu caău cụa men giông khi boơ sung vào dịch leđn men:
Maơt đoơ nâm men: tređn 120 trieơu tê bào / mL Tư leơ nạy choăi: tređn 10 -15%
Khođng nhieêm táp khuaơn.
c) Đêm sô tê bào nâm men, đêm sô tê bào nạy choăi Tiên hành
Laĩc đeău canh trường.
Pha loãng canh trường: lây moơt ông nghieơm, cho vào 9 ml nước vođ khuaơn. Dùng pipet lây 1ml canh trường nâm men cho vào ông nghieơm, laĩc đeău. Khi đó mău đã được pha loãng 10 laăn. Tiêp túc pha loãng canh trường đên tư leơ thích hợp.
Đaịt lá kính leđn khoang cụa buoăng đêm, dùng tay ân nhé cho lá kính dính vào phiên kính cụa buoăng đêm. Thực hieơn các thao tác vođ khuaơn và dùng pipet lây moơt giĩt nhỏ leđn khe hở giữa phiên kính và lá kính. Chú ý khođng đeơ canh trường rơi xuông các rãnh và khođng đeơ táo thành bĩt khí.
Đaịt buoăng đêm leđn khay kính, đeơ yeđn trong 3 – 5 phút roăi tiên hành đêm sô tê bào trong 5 ođ lớn chéo nhau (có đánh dâu x).
Hình 2.3: Buoăng đêm Thoma-Goriaep
Sô tê bào trong 1ml canh trường được tính theo cođng thức: 1000 c b 4000 a× × × = x Trong đó:
x: lượng tê bào trong 1ml. a: sô tê bào trong 5 ođ lớn. b: tỷ leơ pha loãng canh trường. c: sô ođ nhỏ trong 5 ođ lớn.
Chú ý:
Với những tê bào naỉm tređn đường gách thì chư đêm những tê bào có hơn ½ phaăn naỉm trong ođ đang đêm.
Tê bào được xem là đang naơy choăi khi có tê bào con bé hơn hoaịc baỉng ½ tê bào mé, nêu tê bào con lớn hơn ½ tê bào mé thì phại tính là2 tê bào.
Trước và sau khi dùng, buoăng đêm và lá kính phại được rửa sách kỹ baỉng nước cât roăi dùng bođng sách đeơ lau khođ.
Khi sô tê bào trong 1 ođ quá 16 thì neđn pha loãng canh trường hơn.
d) Đêm sô tê bào chêt Tiên hành:
Pha loãng canh trường như tređn.
Lây moơt ông nghieơm khác, lây 1ml dịch đã pha loãng, nhỏ khoạng 2 – 3 giĩt xanh methylene vào ông nghieơm, laĩc đeău.
Làm tieđu bạn giĩt ép, đêm ngay đeơ tránh thuôc nhuoơm ức chê vi sinh vaơt. Quan sát dưới kính hieơn vi, đêm sô tê bào sông, chêt. Tê bào chêt baĩt màu xanh.
Toơng sô tê bào phại naỉm trong khoạng 100 - 250 nêu lớn hơn phại pha loãng hơn nữa.
2.3.5. Phương pháp cạm quan : sử dúng phép thử cho đieơm chât lượng sạn phaơm
Đađy là phép thử xác định chât lượng sạn phaơm sau cùng. Phép thử này được tiên hành tređn các chuyeđn gia đã qua đào táo hay tređn các thành vieđn đã trại qua sự huân luyeđn trước khi thử. Tuy nhieđn do khođng có đieău kieơn đeơ mời các chuyeđn gia cũng như khođng có thời gian đeơ huân luyeơn thành vieđn vì vaơy trong phám vi bài luaơn vaín này chúng tođi chư cho thử tređn moơt sô thành vieđn. Phép thử được tiên hành và đánh giá theo bạng đieơm sau :
Bạng 2.2 : Bạng đieơm đánh giá chât lượng sạn phaơm
Teđn chư tieđu Đieơm chưa có trĩng lượng Yeđu caău Đoơ trong và màu saĩc
5 Chât lỏng trong suôt, khođng vaơn đúc và vaơt theơ lá nhỏ, màu hoàn toàn đaịc trưng cho sạn phaơm
4 Chât lỏng trong suôt, khođng vaơn đúc và có ít vaơt theơ lá nhỏ, màu đaịc trưng cho sạn phaơm
3 Chât lỏng hơi đúc có tương đôi nhieău vaơt theơ lá nhỏ, màu hơi khác moơt ít so với màu đaịc trưng cụa sạn phaơm
2 Chât lỏng hơi đúc có khá nhieău vaơt theơ lá thođ traăm trĩng, màu khác nhieău so với màu đaịc trưng cụa sạn phaơm
1 Chât lỏng đúc nhieău laĩng caịn có nhieău vaơt theơ lá thođ traăm trĩng, màu khođng đaịc trưng cho sạn phaơm 0 Vaơn đúc, màu baơn, sạn phaơm bị hỏng.
Mùi 5 Hòa hợp thơm dịu, hoàn toàn đaịc trưng cho sạn phaơm 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đaịc trưng cho sạn phaơm
nhưng hơi khó nhaơn thây
3 Hơi noăng, thoạng mùi phú, ít đaị trưng cho sạn phaơm 2 Noăng, thoạng mùi lá, ít đaịc trưng cho sạn phaơm 1 Noăng haíng, mùi lá rõ, khođng đaịc trưng cho sạn phaơm 0 Có mùi lá khó chịu cụa sạn phaơm hỏng
Vị 5 Hòa hợp eđm dịu tôt, hoàn toàn đaịc trưng cho sạn phaơm 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, haơu vừa phại, đaịc trưng cho sạn
phaơm bình thường
3 Chưa hòa hợp, hơi gaĩt và xôc, haơu yêu, ít đaịc trưng cho sạn phaơm
2 Đaĩng xôc, thoạng vị lá, rât ít đaịc trưng cho sạn phaơm 1 Đaĩng xôc mánh, vị lá rõ, khođng đaịc trưng cho sạn phaơm 0 Có vị lá khó chịu cụa sạn phaơm hỏng
Bạng 2.3 : Bạng heơ sô quan trĩng cụa từng chư tieđu
Sô thứ tự Chư tieđu Heơ sô quan trĩng 1
2 3
Đoơ trong và màu saĩc Mùi
Vị
0.8 1.2 2.0
Bạng 2.4 : Bạng đánh giá mức chât lượng rượu
STT Mức chât lượng Sô đieơm chung
Yeđu caău tôi thieơu veă đieơm trung bình chưa có trĩng lượng
1 Lối tôt 18.6 – 20.0 Mùi 4.8
Vị 4.8
2 Lối khá 15.2 – 18.5 Mùi 3.8
3 Lối trung bình 11.2 – 15.1 Moêi chư tieđu 2.8
4 Lối kém 7.2 – 11.1 Moêi chư tieđu 1.8
5 Lối rât kém 4.0 – 7.1 Moêi chư tieđu 1.0 6 Lối hỏng 0 – 3.9 Moêi chư tieđu <1.0
Chương 3
KÊT QUẠ VÀ BÀN LUAƠN 3.1 Khạo sát nguyeđn lieơu nghieđn cứu
3.3.1 Dưa hâu
Trước khi tiên hành thí nghieơm chúng tođi khạo sát sơ boơ veă moơt sô các tính chât chư tieđu cụa nguyeđn lieơu đưa vào sạn xuât.
Kêt quạ khạo sát :
Bạng 3.1 : Tỷ leơ các phaăn cụa dưa hâu
Các phaăn Tỷ leơ (%) Tỷ leơ dịch ép (ml/g) Vỏ 40 - Thịt quạ 58 0.825 Hát 2 -
Bạng 3.2 Thành phaăn cụa dưa hâu
Thành phaăn Đơn vị Giá trị
Hàm lượng chât khođ hòa tan 0Bx 8-9
Hàm aơm % 90
Đường khử % 3.34
pH - 5.7
3.3.2 Dađu tađy
Tương tự như dưa hâu ta cũng tiên hành khạo sát các chư tieđu cụa nguyeđn lieơu dađu tađy sử dúng.
Kêt quạ khạo sát :
Bạng 3.3Tỷ leơ các phaăn cụa dađu tađy
Các phaăn Tỷ leơ Tỷ leơ dịch ép
Cuông quạ 5% -
Thịt quạ 95% 0.7ml/g
Bạng 3.4 Các thođng sô hóa lý cụa dađu tađy
Thành phaăn Đơn vị Giá trị
Hàm lượng chât khođ hòa tan 0Bx 5-6
Hàm aơm % 85
Đường khử % 2.41
pH - 3.31
Nhaơn xét
Chúng tođi nhaơn thây thành phaăn cụa dưa hâu, dađu tađy có hàm lượng nước khá cao thích hợp ép lây nước đeơ chê rượu.
Dịch dưa hâu và dađu đeău có hàm lượng chât khođ hòa tan thâp 8-90Bx và 5- 60Bx như vaơy khi tiên hành leđn men ta caăn phại boơ sung theđm đường đeơ có noăng đoơ chât khođ phù hợp.
Trong quá trình khạo sát nguyeđn lieơu chúng tođi nhaơn thây thành phaăn chụ yêu cụa dưa hâu là nước và đường, các thành phaăn vi lượng khác khá ít (Bạng 1.1) đoăng thời dưa hâu có mùi nhé và có theơ bị mât đi trong quá trình leđn men vì vaơy chúng tođi quyêt định phôi troơn theđm dađu tađy nhaỉm boơ sung theđm các chât dinh dưỡng đoăng thời táo neđn hương thơm và màu saĩc đép cho sạn phaơm rượu vang sau này .
3.4 Chĩn chụng giông vi sinh vaơt
Khi tiên hành chĩn chụng chúng tođi khạo sát các yêu tô như : tôc đoơ sinh trưởng, khạ naíng leđn men, hương vị sạn phaơm táo thành đeơ quyêt định chụng nào thích hợp nhât đeơ đưa vào sạn xuât.
3.4.1 Khạo sát tôc đoơ sinh trưởng
Các chụng giông do phòng thí nghieơm vi sinh cung câp goăm 4 chụng nâm men được kí hieơu là V1, V2, V3, V5.
Sau khi nhaơn giông, chúng tođi tiên hành giữ giông tređn thách nghieđng và sau đó nhađn giông qua 2 câp đeơ khạo sát đường cong sinh trưởng :
Câp 1 : Nuođi cây trong ông nghieơm chứa 10ml dịch malt 80Bx
Câp 2 : Cây chuyeăn từ ông nghieơm sang erlen 250ml chứa 50ml dịch malt 80Bx và 50ml dịch dưa hâu. Nuođi tređn máy laĩc
Sau 8h, 12h, 16h, 20h, 24h nuođi cây chúng tođi thu được kêt quạ như sau :
Bạng 3.5 : Toơng sô tê bào và tỷ leơ nạy choăi cụa các chụng theo thời gian nuođi cây Chụng nâm men V1 V2 V3 V5 Thời gian (h) Toơng sô tê bào (Trieơu TB/ml) Tỷ leơ nạy choăi (%) Toơng sô tê bào (Trieơu TB/ml) Tỷ leơ nạy choăi (%) Toơng sô tê bào (Trieơu TB/ml) Tỷ leơ nạy choăi (%) Toơng sô tê bào (Trieơu TB/ml) Tỷ leơ nạy choăi (%) 8 38 38 48 43 50 45 45 41 12 56 23 68 26 65 29 58 25 16 340 43 470 51 415 45 455 48 20 380 21 512 28 490 25 510 24 24 365 19 520 27 455 24 485 22
Hình 3.1 : Đường cong sinh trưởng cụa các chụng
Bạng 3.6 Tỷ leơ sông chêt cụa 4 chụng sau 16h nuođi cây
Chụng nâm men Tỷ leơ tê bào chêt(%)
V1 2.1
V2 1.2
V3 1.4
Nhaơn xét
Dựa vào đoă thị chúng tođi nhaơn thây đường cong sinh trưởng cụa các chụng goăm 3 giai đốn : pha lag, pha log và pha oơn định.
Pha lag kéo dài từ thời đieơm 8h đên sau 12h nuođi cây. Trong giai đốn này, tê bào nâm men được cây chuyeăn từ mođi trường dịch malt 100% sang mođi trường chứa malt:dịch dưa phôi troơn theo tỷ leơ 1:1. Tuy đã được hốt hóa ở câp 1, tê bào men đã baĩt đaău sinh trưởng mánh, nhưng do ở câp 2 tê bào men được cây vào mođi trường mới (chứa dịch dưa) vì vaơy tê bào men caăn có thời gian đeơ làm quen thích nghi daăn với mođi trường dịch dưa. Do đó ở giai đốn này sô tê bào có taíng leđn nhưng chưa cao. Ở giai đốn này chúng tođi thây văn chưa có sự khác bieơt rõ reơt giữa các chụng.
Pha log từ sau 12h đên 16h : đađy là pha taíng trưởng bieơu hieơn rõ ở đoơ dôc khá lớn tređn đoă thị. Ở pha này tê bào nâm men sinh sạn mánh tỷ leơ nạy choăi taíng cao và đát cực đái sau 16h nuođi cây. Ở giai đốn này chúng tođi nhaơn thây đoơ dôc ở đốn đoă thị cụa chụng V1 thâp hơn so với cụa 3 chụng còn lái chứng tỏ khạ naíng sinh trưởng cụa chụng V1 trong mođi trường dịch dưa yêu hơn so với 3 chụng V2, V3, V5. Nhìn vào đoă thị chúng tođi nhaơn thây cạ 3 chụng V2, V3, V5 đeău có tôc đoơ phát trieơn có theơ nói là tương đương nhau.
Pha oơn định theơ hieơn rõ từ sau 16 nuođi cây trở đi: ở pha này sô lượng tê bào mới sinh ra bao giờ cũng baỉng với sô lượng tê bào chêt đi. Toơng sô tê bào sông là haỉng sô.
Nhaơn xét veă tỷ leơ nạy choăi : chúng tođi nhaơn thây sau 8h nuođi cây câp 1 trong mođi trường malt tỷ leơ nạy choăi tương đôi cao chứng tỏ nâm men đang trong giai đốn sinh trưởng mánh. Sau 12h nuođi cây tỷ leơ nạy choăi lái giạm xuông. Đieău này có theơ giại thích như sau: sau 8h nuođi cây câp 1 chúng tođi chuyeơn sang mođi trường câp 2 (có chứa 50% dịch dưa) do đó tê bào hâp thú chât dinh dưỡng sinh toơng hợp những chât mới caăn thiêt đeơ thích nghi, trong giai đốn này sự sinh sạn bị hán chê. Từ 12h đên 16h, tỷ leơ nạy choăi taíng nhanh và đát cực đái. Đó là do sau khi trại qua moơt giai đốn làm quen với mođi trường mới (từ 8h đên 12h) tê bào nâm men baĩt đaău bước vào giai đốn sinh sạn mánh. Sô lượng tê bào cũng taíng leđn rât nhanh chóng. Đên giai đốn oơn định (từ 16h đên 24h), các choăi baĩt đaău tách ra khỏi tê bào mé khiên cho toơng sô tê bào có taíng leđn, tuy nhieđn các tê bào cũng daăn daăn
già đi, lượng chât dinh dưỡng cũng giạm vì thê tỷ leơ nạy choăi baĩt đaău giạm xuông. So sánh tỷ leơ nạy choăi cụa 4 chụng chúng tođi nhaơn thây chụng V2 có tỷ leơ nạy choăi cực đái cao nhât, thâp nhât là V1. Như vaơy V2 là chụng có khạ naíng sinh sạn tôt nhât trong mođi trường dịch dưa.
Khạo sát đường cong sinh trưởng chúng tođi nhaơn thây thời đieơm thích hợp đeơ boơ sung giông nâm men là sau 16h nuođi cây : toơng sô tê bào cao và có tỷ leơ nạy choăi cực đái.
Nhaơn xét veă tỷ leơ tê bào chêt : chúng tođi chư khạo sát tỷ leơ tê bào chêt ở thời đieơm được chĩn baĩt đaău boơ sung giông nâm men đeơ tính toán lượng giông caăn cho vào dịch leđn men. Xét ở thời đieơm sau 16h nuođi cây chúng tođi nhaơn thây cạ 4 chụng đeău có tỷ leơ tê bào chêt thâp <3%, toơng sô tê bào và tỷ leơ nạy choăi cao chứng tỏ cạ 4 chụng đeău thích hợp đeơ leđn men dịch dưa. Ở đađy chúng tođi cũng nhaơn thây chụng V2 có tỷ leơ tê bào chêt thâp nhât, V1 có tỷ leơ tê bào chêt cao nhât, chứng tỏ khạ