4.3.1. Nhu cầu Oxygen
Oxygen đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh khối của nấm men. Quá trình tạo ra sản phẩm chủ yếu của lên men bia là cồn được hình thành trong điều kiện kị khí. Tuy nhiên, để đạt hiệu quả cao trong lên men bia khối dịch cần đạt yêu cầu về mật độ nấm men. Oxygen cần thiết để nấm men tổng hợp sterols và acid béo nhằm tăng sinh khối quá trình này xảy ra trong điều kiện nồng độ oxygen dưới tối ưu (suboptimal concentrations). Thực ra nấm men có khả năng phát triển trong điều kiện kị khí khi và chỉ khi một hợp chất ngoại sinh thêm vào giúp nấm men có thể tổng hợp sterol và acid béo từ carbohydrate. Sterols và acid béo có rất nhiều trong malt tuy nhiên trong quá trình sản xuất chúng ta đã ngăn không cho chúng hiện diện trong dịch nha.
Oxygen hòa tan (DO) tối ưu cung cấp cho bất cứ chủng nấm men bia nào cũng cần phải có độ tinh khiết và chất lượng cao. Nhu cầu oxy trong lên men phụ thuộc vào chủng nấm men. Giống nấm men ale được chia làm 4 nhóm dựa vào nhu cầu về oxy. Tương tự chủng nấm men lager cũng có nhu cầu về oxy trong quá trình rất rộng. Nhu cầu cụ thể về oxy của một chủng nấm men sử dụng trong sản xuất bia hoặc được cung cấp bởi nhà phân phối giống hoặc từ thực tế sản xuất.
4.3.2. Nước
Nước rất cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nấm men. Không có nước không thể có qua trình đồng hóa thức ăn và quá trình trao đổi chất bên trong tế bào
4.3.3. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon là nguồn chủ yếu liên quan đến quá trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Nấm men có khả năng đồng hóa hoàn toàn đường glucose, fructose và mannose. Ngoài ra, tùy thuộc vào chủng giống, nấm men còn có thể đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần nào đó đường galactose.
Đường disaccarit quan trọng cần quan tâm tới là saccarose, lactose, melibiose. Nấm men đồng hóa lên men rất tốt maltose và saccarose, đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần đường lactose. Riêng melibiose chỉ lên được khi có enzyme melibiose.
Nấm men nổi (lên men nổi) chỉ lên men được 1/3 rafinose sau khi phân giải ra một phân tử fructose và melibiose. Nấm men chìm (lên men chìm) có khả năng thủy phân hoàn toàn rafinose do có enzyme invectase và melibiose.
Các polisaccarit cần được thủy phân hoàn toàn bằng acid hoặc enzyme thì nấm men mới có thể sử dụng được.
4.3.4. Nguồn nitơ
Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2) và imin (-NH-) để tổng hợp nên protein và các hợp chất khác của nguyên chất. Nấm men đồng hóa được các hợp chất acid amin và nitơ vô cơ. Dễ đồng hóa hơn cả là ion NH4+ và amoniac NH3 với lượng sử dụng lớn nhất là 20 – 35 mg nitơ/109 tế bào. Nguồn nitơ được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàn toàn là urê
Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin. Tuy nhiên nếu cho các acid amin vào môi trường thì các quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn. Nấm men đồng hóa các acid amin bằng cách amin hóa (tách NH3 ra khỏi các chất), do đó các nguồn nitơkhác nhau sẽ có ảnh hưởng rất ít tới hàm lượng acid amin trong tế bào nấm men.
Bảng 4: Trình tự sử dụng các acid amin của nấm men bia
Nhóm A Nhóm B Nhóm C Nhóm D Arginin Asparagin Acid aspartic Acid glutamic Glytamin Lysin Serin Threonin Histidin Isolơxin Lơxin Methionin Valin Alanin Glyxin Phenylalanin Tryptophan Tyrosin Prolin
(Nguồn: Khoa Học-Công Nghệ Malt Và Bia, Nguyễn Thị Hiền cùng cộng sự, 2007)
Nấm men bắt đầu hoạt động bằng việc sử dụng các acid amin cảu nhóm A. Chỉ khi nào các acid amin của nhóm A đã được sử dụng hết thì nấm men mới chuyển sang hấp thụ các acid amin của nhóm B. Các acid amin của nhóm C và D hầu như không được sử dụng trong quá trình lên men chìm cũng như trong lên men nổi.
4.3.5. Các chất khoáng
Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng nhất định các chất khoáng để bảo đảm cho tế bào phát triển. Nếu trong môi trường tổng hợp thì các chất khoáng sau đây cần thiết cho nấm men.
Bảng 5: Các khoáng chất cần thiết cho nấm men
(Nguồn: Khoa Học-Công Nghệ Malt Và Bia, Nguyễn Thị Hiền cùng cộng sự, 2007)
Nếu nồng độ các chất này trong môi trường ít hơn nồng độ đã nói ở trên thì quá trình phát triển sẽ chậm lại, còn nếu nhiều hơn thì áp suất thẩm thấu tăng, ức chế qúa trình sinh sản. Chất khoáng Hàm lượng K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O MgSO4.4H2O FeSO4.7H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O Na2SO4 CaCl2 1,00 – 2,00 1,00 – 2,00 0,20 – 0,50 0,02 – 0,10 0,05 – 0,20 0,02 – 0,10 0,01 – 0,05 0,01 – 0,02 0,02 – 0,05
Photpho rất cần thiết cho quá trình tổng hợp các thành phần nguyên sinh chất và có trong thành phần của nhiều coenzyme, dùng để photpho hóa các hydrocacbon trong quá trình oxy hóa. Photpho còn tham gia vào những phản ứng vận chuyển năng lượng. Nó được cung cấp dưới dạng muối kali hay natri. Nếu lượng photpho ít thì tổng hợp protein giảm và tổng hợp lipid tăng.
Kali và natri chiếm 1/5 – 3/4 hàm lượng chất tro. Nếu thiếu Na+ hoặc K+ trong môi trường nuôi cấy thì quá trình phát triển sẽ bị chậm lại.
Magie có khả năng thúc đẩy quá trình sinh sản và tổng hợp riboflavin. Hàm lượng Mg2+ có trong tế bào nấm men là 0,3 – 0,4 %.
Kẽm tuy có rất ít trong môi trường nhưng đóng vai trò cực kì quan trọng. Nhờ có Zn, các quá trình oxy hóa xảy ra hoàn toàn và khả năng đồng hóa glucose tăng.
4.3.6. Các chất kích thích sinh trưởng
Thường là các vitamin và các acid amin. Các loại vi sinh vật khác nhau có nhu cầu về vitamin rất khác nhau. Đa số các chủng nấm men đang ở giai đoạn nhân giống cần đến isositol, canxi pantothenat, thiamin và đặc biệt là biotin.
Tế bào sử dụng các chất này để tạo tế bào chất. Nồng độ của vitamin có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển là 0,01 – 1,10 mg/l. Các vitamin quan trọng như B1, B3, B6, B7.
4.3.7. Chuyển hóa Hydrocarbon trong dịch nha
Dịch nha chứa các loại đường như Fructose, Glucose, Maltose, Maltotriose và dextrin. Nấm men dùng trong sản xuất bia chỉ sử dụng được 4 loại đường trên ngoại trừ đường dextrin để tạo ra sản phẩm bậc 2 và phục vụ nhu cầu năng lượng của tế bào. Glucose và Fructose luôn luôn được ưu tiên sử dụng trước sau đó mới tới đường Maltose và Maltotriose. Việc sử dụng đường Maltose và Maltotriose phụ thuộc vào nồng độ đường glucose có trong dịch nha khi Glucose cao (lớn hơn 1 % w/v) thì gene MAL loci (gene điều khiển chuyển hóa Maltose và Maltotriose) bị khống chế. Khi hàm lượng glucose giảm xuống còn 40- 50 % thì quá trình sử dụng Maltose và Maltotriose mới bắt đầu. Như vậy việc có mặt của glucose trong dịch nha là nguyên nhân làm giảm tốc độ lên men.
Một trong những chất bài tiết của nấm men trong quá trình lên men là Ethanol. Đây là chất có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của sản phẩm bia. Ngoài ra, thành phần các chất sinh ra từ nấm men cũng có ảnh hưởng đến chất lượng như mùi. Sự hình thành những sản phẩm này phụ thuộc vào cân bằng chuyển hóa trong môi trường nuôi cấy và có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất của sản phẩm. Chủng nấm men, nhiệt độ lên men, tỉ lệ thế liệu, pH nước nha, tỉ trọng nước nha, nồng độ oxy, áp suất… Đều là những yếu tố có ảnh hưởng đến sản phẩm sinh ra từ nấm men.
Một vài chất dễ bay hơi cũng đóng vai trò rất lớn trong việc quyết định hương bia, trong khi những chất khác lại đóng vai trò làm hương nền của sản. Các chất đó bao gồm ester, carbonyl, acid hữu cơ, hợp chất sulfur, amine, phenol, và một số dạng tạp 4.4.1. Cồn (Alcohols)
Thành phần alcohol chủ yếu do nấm men sinh ra là ethanol, tuy nhiên một vài loại cồn khác cũng được tạo ra như các cồn bậc cao, dầu fusel các thành phần này góp phần quan trọng đến hương bia. Sự hình thành các sản phẩm cồn liên quan đến con đường tổng hợp protein của tế bào nấm men. Cồn bậc cao có thể được tổng hợp thông qua 2 cách: từ carbohydrate của dịch nha (đồng hóa) hoặc trong quá trình chuyển hóa amino acid (dị hóa). Hai phương cách để tạo ra các sản phẩm cồn này bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, nhưng xét về tổng thể khi nồng độ amino acid trong môi trường thấp cồn sẽ được tạo ra bằng con đường đồng hóa ngược lại khi hàm lượng amino acid trong môi trường cao thì cồn sẽ được tạo ra bằng con đường dị hóa. Trong trường hợp tổng hợp n-propanol, chúng chỉ được tạo thành bằng cách đồng hóa ở đây hàm lượng amino acid dù ít hay nhiều cũng không liên quan. Việc hoán đổi nhánh trong chuỗi amino acid có tầm quan trọng trong chuyển hóa các hợp chất này thành cồn bậc cao. Các yếu tố tác động bao gồm: Thành phần của dịch nha, đặc biệt Nitơ chứa trong acid amin. Chủng nấm men chọn để tiến hành lên men cũng có ảnh hưởng đến việc tạo ra cồn. Hàm lượng cồn sẽ phụ thuộc vào nhiệt độ lên men, với sự gia tăng nhiệt lượng cồn bậc cao trong sản phẩm bia sẽ tăng lên.
3.3.5. Ester
Trong quá trình lên men hàng trăm ester có thể được tạo ra bởi sự kết hợp giữa rượu bậc cao và Acyl- coenzyme A (Acyl- CoA) được kích hoạt. Các ester và hương thơm thường gặp như: ethyl acetate (mùi trái cây); Isoamyl acetate (mùi chuối/ táo);
Isobutyl acetate (mùi chuối); 2- phenylethyl acetate (mùi mật ong/ hoa hồng); Các acid béo mạch từ 6- 10 tạo thành ester có mùi táo chua hay hương hồi hương thơm đặc trưng. Sự có mặt của Ethanol với hàm lượng cao là điều kiện để các ester này phát huy mùi thơm góp phần tạo giá trị cho sản phẩm.
3.3.5. Các hợp chất Sulfur
Hợp chất sulfur được tạo ra trong quá trình chuyển hóa của nấm men và nằm trong bia thành phẩm. Chúng sẽ gây nên mùi khó chịu và chỉ được chấp nhận với nồng độ rất thấp. Hợp chất sulfur thường có trong bia là Dimethylsulfur (DMS) có mùi đường bắp cháy. Các tiền chất của DMS là S- methylmethionine (SMM); Dimethylsulfoxide (DMSO) là những chất được tạo ra trong quá trình Malt hóa. Để làm giảm hàm lượng DMS chúng ta có thể làm giảm hàm lượng tiền chất bằng biện pháp thích hợp trong quá trình Malt hóa.
4.4.2. Diacetyl and Pentane-2,3-dione
Sự hiện diện của diketone như diacetyl và pentane-2, 3 dione là những chất thường có trong sản phẩm bia chúng góp phần tạo nên tính chất mùi và vị. Chúng được mô tả có mùi bơ scotch, mật ong hoặc mùi kẹo bơ (butterscotch and honey or toffee). Hàm lượng ngưỡng của diacetyl trong bia lagers là 0,1 – 0,14 mg/l và cao hơn một ít trong bia ale. Hàng năm đều có những cuộc hội nghị vể các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ diacetyl và phương pháp đo chỉ số này.
Diacetyl và pentane-2, 3-dione được hình thành bên ngoài tế bào nấm do quá trình oxy hóa hợp chất α-acetolactate và decarboxylation α-acetohydroxybutyrate .
Sự có mặt của diacetyl trong bia phụ thuộc vào quá trình lên men và khả năng phân hủy hợp chất này trong quá trình lên men phụ. Hàm lượng diacetyl còn phụ thuộc vào các điều kiện lên men như pH; nồng độ α-acetolactate ; nhiệt độ lên men; hàm lượng oxy; độ lên men; và hàm lượng các ion kim loại. Cuối cùng góp phần vào việc tăng hàm lượng diacetyl trong bia do nhiễm khuẩn như Pediococcus hoặc Lactobacillus.