Phương phỏp sắc ký phõn bố trờn giấy dựa vào sự khỏc nhau về hệ số phõn bố cỏc chất tan giữa hai pha lỏng khụng trộn lẫn.
Người ta mang lờn một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch nghiờn cứu rồi nhỳng đầu giấy cú mang dung dịch nghiờn cứu đú vào chậu dung mụi hữu cơ linh động bóo hoà nước (như rượu butilic).
Trong quỏ trỡnh di chuyển chậm của dung mụi qua ống mao dẫn của giấy, cỏc cấu tử riờng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khỏc nhau, nhờ vậy mà hỗn hợp được phõn chia ra thành cỏc cấu tử thành phần.
Sự chuyển dịch của cỏc chất trong khi tiến hành sắc ký cú thể giải thớch như sau: Cỏc sợi xenlulozơ của giấy cú ỏi lực lớn đối với nước và hấp phụ nước trong dung mụi hữu cơ bóo hoà nước ( đúng vai trũ là chất mang ). Ở đõy pha tĩnh là nước, cú chứa trong nước khoảng 20%, cũn dung mụi hữu cơ là chất lỏng linh động khi
dung mụi chảy qua phần giấy cú chứa dung dịch nghiờn cứu thỡ một phần cỏc chất chuyển vào dung mụi ( pha động ). Khi dung mụi tới phần giấy khụng cú chứa cỏc chất phõn tớch thỡ ở đú lại xảy ra quỏ trỡnh phõn bố cỏc chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung mụi hữu cơ. Lần này, cỏc chất lại chuyển từ ( dung mụi ) pha hữu cơ sang pha nước. Như vậy, nếu cho dung mụi chuyển dịch liờn tục qua giấy, cỏc chất phõn tớch sẽ được chuyển từ điểm mang ban đầu đến một điểm khỏc trờn giấy theo hưưúng chảy của dung mụi do kết quả của quỏ trỡnh tỏch phõn bố liờn tục giữa hai pha tĩnh và động.
Quỏ trỡnh phõn tớch này được tiến hành trong thiết bị kớn bóo hoà của dung mụi và nước. Khi tuyến dung mụi đó đi được đoạn đường 30 – 40 cm, người ta lấy giấy ra sấy khụ và phun thuốc nhuộm màu, nhờ đú xỏc định được vị trớ của cỏc cấu tử trờn dải giấy. Dải giấy sau khi hiện màu gọi là sắc ký đồ.
Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyển dịch (ký hiệu là Rf ) cú ý nghĩa rất lớn. Hệ số vận tốc chuyển dịch Rf là tỉ số giữa quóng đường đi được của chất so với quóng đường chuyển dịch của dung mụi.
Rf = Quóng đường dịch chuyển của chất / Quóng đường dịch chuyển của dung mụi. Rf: Là đại lượng đặc trưng và khụng đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xỏc định.
Tuỳ thuộc vào hướng hoặc chiều chuyển dịch của dung mụi, người ta phõn biệt một số dạng sắc ký như sau:
* Sắc ký nghịch: Khi dung mụi chảy dịch từ dưới lờn trờn. * Sắc ký thuận: Khi dung mụi chảy từ trờn xuống.
* Sắc ký vũng trũn: Khi dung mụi chuyển dịch từ tõm ra xung quanh.
Ngoài ra, người ta cũn phõn biệt: Sắc ký một chiều khi cho dung mụi chuyển dịch theo một hướng nhất định. Sắc ký hai chiều khi cho dung mụi chuyển dịch theo một chiều nào đú, sau đấy sấy khụ và cho dung mụi chảy theo một chiều khỏc vuụng gúc với chiều ban đầu.
Phương phỏp sắc ký giấy một chiều ( cú thể thuận hoặc nghịch ) là phương phỏp đơn giản nhất, chỉ dựng một hệ dung mụi nào đú. Khả năng phõn tớch kộm hơn sắc ký hai chiều.
Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng cỏc vết màu thu được khụng gọn, cũn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn.
Để định lượng cỏc axit amin người ta thường sử dụng cỏc phương phỏp sau:
* So sỏnh bằng mắt thường cường độ màu và diện tớch cỏc vết màu của hợp chất đó cho với cường độ màu và diện tớch cỏc vết màu của hỗn hợp đối chứng đó biết rừ nồng độ.
* Đo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung mụi thớch hợp. Sai số của phương phỏp này khoảng 3 – 6 %.
* Dựng densitomet đo mật độ màu của cỏc vết trong khi cho ỏnh sỏng xuyờn qua. Độ chớnh xỏc của phộp đo tăng lờn đến 10 – 15% [8,9]